Дизайн исследования – проспективное, поперечное. Работа выполнена в 2022 г. на базе ГБУЗ МО «Московский областной клинический противотуберкулезный диспансер», ГКУЗ МО «Малаховский детский туберкулезный санаторий», ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний», Москва. Молекулярно-генетические исследования проведены на базе бактериологической лаборатории ГБУЗ МО «Московский областной клинический противотуберкулезный диспансер». На проведение исследований получено разрешение локального этического комитета ГБУЗ МО «Московский областной клинический противотуберкулезный диспансер» (протокол № 4 от 15.12.2021 г.). Для участия детей в исследовании от родителей или их законных представителей было получено добровольное информированное согласие.

В исследование включено 87 детей из контакта с больными ТБ, которые разделены на три группы: 1-я группа (n = 27) – дети с установленным диагнозом ТБ, 2-я группа (n = 34) – дети с наличием ТИ по результатам туберкулинодиагностики без признаков локального специфического процесса; 3-я группа (n = 26) – дети без признаков ТИ по результатам кожных проб и локального процесса (условно здоровые дети). Средний возраст детей составил 5,6 ± 0,205 года.

Всем пациентам проводилась комплексная оценка состояния здоровья. Обследование включало стандартные общеклинические, клинико-рентгенологические и лабораторные исследования согласно Приказу МЗ РФ № 109 от 21.03.2003 г. и клиническим рекомендациям по ЛТИ [9]. Кожные пробы (проба Манту с 2 ТЕ (ППД-Л), проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (Диаскинтест® АТР, CFP10-ESAT6 0,2 мкг) проводили на момент включения в исследование. Согласно определению ВОЗ 2022 года, ТИ представляет состояние стойкого иммунного ответа на стимуляцию антигенами микобактерий туберкулеза без признаков клинических проявлений ТБ. Проба с АТР по данным многих авторов позволяет дифференцировать поствакцинальную и инфекционную аллергию у детей аналогично лабораторным иммунологическим тестам, рекомендованным для выявления ТИ в мире [10][11].

Среди всех обследованных детей 10 пациентов (11,5%) получали противотуберкулезную терапию, из них 8 человек входили в группу 1; два ребенка – в группу 2 (были исключены из последующего анализа). Все дети групп 2 и 3 находились в специализированном санатории по контакту с больными ТБ. В период забора крови ни один пациент, включенный в исследование, не имел проявлений острой респираторной инфекции или обострения аллергического заболевания.

Всем детям провели молекулярно-генетическое исследование: выделение ДНК и количественное определение TREC и KREC. Выделение ДНК выполняли из сухого пятна крови (кровь собирали на ДНК-карты, «Алкор Био» РУ РФ № РЗН 2016/4615) согласно инструкции набора для выделения ДНК из сухих пятен «Экстра-ДНК-Био», а определение TREC и KREC- согласно инструкции набора реагентов для диагностики in vitro «Иммуно-БиТ» для количественного определения ДНК TREC и KREC методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по ТУ 21.20.23-002-17608775-2021.

Для проведения статистической обработки фактического материала применялись методы статистического анализа с использованием пакета программ BioStat LE 7.6.5.0, NCSS 2022, v22.0.4. Определяли М ± SEM; доверительный интервал с уровнем р = 0,95 (95% CI) и медиану (МЕ); квартиль верхний и нижний р = 0,25 и р = 0,75 (Q 25% : Q 75%). Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р ≤ 0,05. Для оценки значимости признаков применяли дисперсионный анализ.

При распределении полученных значений копий TREC и KREC на 105 клеток в сухих пятнах крови мы учитывали показатели квартилей [12]: верхнего и нижнего (Q 25% : Q 75%). У детей раннего и дошкольного возраста в группе условно здоровых (3-я группа) для TREC нижняя граница соответствовала 175, верхняя – 760. Для KREC: нижняя граница – на уровне 540, верхняя – 2170. Во второй группе детей с ТИ, не получающих противотуберкулезную терапию (n = 32), установили TREC/105 PBMC на среднем уровне 576,6 ± 65,7 и KREC/105 PBMC – 1590,5 ± 245,3. Сравнивая результаты TREC/105 PBMC с показателями детей группы 3, значимых различий не было установлено (t = 2,005; p = 0,205), так же как и по показателям KREC/105 PBMC (t = 2,005; p = 0,938). При анализе результатов «Иммуно-БиТ» у детей первой группы с ТБ установлено, что до начала противотуберкулезной терапии (n = 19) средний уровень TREC/105 PBMC составил 1142,8 ± 166,6, а KREC/105 PBMC – 2156,6 ± 385,2. Сравнивая результаты TREC/105 PBMC больных туберкулезом с показателями детей без ТИ, установили значимые различия (t = 2,02; p = 0,00008). Среди детей группы 2, не получающих противотуберкулезную терапию, по результатам количественного определения ДНК TREC/105 PBMC с учетом верхней границы показателя в 9 случаях (28,1%) установили уровень выше верхней границы референсных значений, средний уровень составил 992,1 ± 99,4, что статистически значимо выше, чем в группе 3 (t = 2,035; p = 0,00002), при этом различий с показателями больных ТБ не было установлено (t = 2,056; p = 0,531). Средний уровень KREC/105 PBMC 1647,9 ± 380,7 был в пределах референсных значений. В остальных случаях (n = 23) у детей с ТИ средний уровень TREC/105 PBMC составил 384,3 ± 38,4, а KREC/105 PBMC – 1455,0 ± 316,1, при этом показатели были в пределах установленных референсных значений. Сравнивая эти результаты с результатами больных ТБ, установили значимые различия (t = 2,05; p = 0,00003), но, сравнивая с показателями детей без ТИ, различий не было установлено (t = 2,02; p = 0,285). Были выделены основные признаки, связанные с туберкулезной инфекцией: наличие или отсутствие противотуберкулезной терапии, результаты пробы с АТР, с ППД-Л и количество TREC и KREC. Дисперсионный анализ показал, что все признаки вносили значимый вклад в оценку ТИ, которые распределились по уровню значимости: противотуберкулезная терапия (F = 42,001; р = 0,000001), реакция на АТР (F = 39,394; р = 0,000001), уровень TREC (F = 12,707; р = 0,000001), реакция на ППД-Л (F = 10,625; р = 0,000006), менее значимым признаком был уровень KREC (F = 3,182; р = 0,039).

Отсутствие эффективных инструментов, в том числе «золотого стандарта», для диагностики и прогнозирования перехода ТИ в активное состояние [13] свидетельствует о необходимости поиска дополнительных методов. Оценка состояния клеточного иммунитета позволяет предположить течение ТБ у детей [14], для оценки функционального состояния клеточного иммунитета в реальном времени мы обратили внимание на количественный анализ кольцевых фрагментов ДНК TREC и KREС [6].

Необходимо подчеркнуть, что до настоящего времени исследований, направленных на оценку уровня эксцизионных колец ДНК TREC и KREC у детей раннего и дошкольного возраста при наличии ТИ не проводилось. Оценивая уровень TREC и KREC у детей раннего и дошкольного возраста при наличии ТИ, мы учитывали результаты специфических иммунологических тестов – внутрикожных тестов с туберкулином и Диаскинтестом. Определив верхние границы уровня TREC у детей с ТИ, мы дополнительно установили в каждом третьем случае (28,1%) активацию Т-клеточного иммунного ответа. Учитывая, что высокий уровень TREC среди детей с наличием ТИ, не получающих противотуберкулезную терапию, соответствовал уровню при развитии ТБ. При этом у каждого пятого ребенка (22,2%) высокий уровень TREC совпал с положительной реакцией на пробу с АТР, подтверждая высокий риск развития ТБ.

Определение показателей TREC и KREC отражает текущее состояние иммунной системы. Согласно нашим данным, определение высокого уровня TREC у детей раннего и дошкольного возраста с ТИ свидетельствует об активности инфекции и может рассматриваться в качестве персонализированного маркера (предиктора) для оценки риска прогрессирования ТИ.

Таким образом, определение уровня TREC у детей позволяет дифференцированно подойти к определению риска прогрессирования ТБ.

При диагностике TREC и KREC у детей раннего и дошкольного возраста с ТИ было установлено, что часть пациентов имеет высокий уровень TREC, соответствующий уровню напряженности клеточного иммунитета при ТБ. Эти данные позволяют рассматривать показатель TREC в качестве персонализированного предиктора риска прогрессирования ТИ.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ССВ, КДА, ПМА

Сбор и обработка материала – КОА, ЛРИ, ЛСВ, ФПН, КАВ, ПАД

Статистическая обработка данных – ПМА, ЛРИ

Написание текста – ПМА

Редактирование – ССВ, КДА