Штаммы, использованные в работе

В работе были использованы следующие штаммы из коллекции НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи: E. coli O157:H7 ATCC43890, P. aeruginosa Pa103, Listeria monocytogenes EGDe, S. aureus Sa78. Все штаммы хранились в 10% глицерине при -70 °С и были разморожены перед началом экспериментов. Рутинно E. coli и P. aeruginosa культивировали на среде LB (Amresco, Испания), L. monocytogenes и S. aureus на среде BHI (BD, США) при 37 °С.

Выращивание бактерий в биоассемблере

Ночную культуру, выращенную в соответствующем питательном бульоне при 37 °С и шутелировании 180 об/мин в течение 16–18 часов, разводили в 100 раз в 2 мл питательного бульона, содержащего 20 мМ Гадовист® (непатентованное название гадобутрол ([ 10-[ 2,3-dihydroxi-1-(hydroxymethyl)propil]-1,4,7,10-tetraazacyclododexan-1,4,7-triacetin(3-)-N1, N4, N7, N10,O1, O4, O7]gadolinium)), стерильно добавленный непосредственно перед засевом. Емкость с культурой заклеивали парафином и помещали в биоассемблер, создающий условия необходимые для магнитной левитации.

Устройство биоассемблера было подробно описано в наших работах и работах наших коллег [6][8].

Биоассемблер вместе с культурой бактерий помещали в термостат на температуру 37 °С и инкубировали в течение указанного в тексте времени. Для наблюдения за формированием агрегатов биоассемблер доставали из термостата и визуально или при помощи камеры фиксировали появление агрегата через специально сделанное смотровое отверстие, расположенное напротив области минимума магнитного поля. Для высевов среду отбирали иглой, проколов парафильм. Агрегат суспендировали в 2 мл физиологического раствора (150 мМ NaCl). Серийные 10-кратные разведения высевали на питательный агар, инкубировали 24 ч и проводили подсчет колоний, определяя абсолютные значения колониеобразующих единиц (КОЕ) в агрегате и в среде.

Окраска бактерий в агрегате дифференциальным красителем

Бактерии выращивали в биоассемблере, как описано выше, определяли объем агрегата, добавляли равный объем красителя Filmtracer™ LIVE/DEAD™ Biofilm Viability Kit (ThermoFisher Scientific, США). Окрашивание проводили в течение 30 мин в темноте. Окрашенные агрегаты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert (Carl Zeiss, Германия). Подсчет зеленых и красных клеток осуществляли с помощью нейросети, как описано в [9].

Окраска бактерий на агаре и в агрегатах конго красным

Связывание конго красного использовали для выявления амилоидных белков курлей. Конго красный добавляли в агар LB до конечной концентрации 25 мкг/мл. Бактерии высевали с помощью бактериологической петли и инкубировали в течение 24 ч при 37 °С. Связывающие конго красный колонии выглядели на агаре красными, не связывающие – белыми. Для окраски бактерий в агрегатах перед засевом бактерий в бульон, содержащий 20 мМ гадобутрол, добавляли конго красный до концентрации 25 мкг/мл. Выращивали бактерии в агрегате в течение 72 часов, осаждали бактерий центрифугированием в течение 10 минут при 4200 об/мин, удаляли среду, как описано выше, и тщательно ресуспендировали в 2 мл 50% этанола, после чего еще раз осаждали бактерий центрифугированием в течение 10 минут при 4200 об/мин. Выход конго красного в спирт определяли с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Получение мутантов клонов E. coli с увеличенной способностью к продукции курлей

Десятикратные разведения ночной культуры штамма E. coli ATCC43890 высевали на агар LB, содержащий 25 мкг/мл конго красного. Инкубировали при 37 °С. Через 24–48 часов культуру рассматривали на предмет появления красных колоний среди белых. Красные колонии аккуратно отбирали и пересевали на такой же агар. Клоны, сохраняющие красную окраску после трех пересевов, оставляли для дальнейших экспериментов.

Статистика

Все эксперименты повторяли не меньше трех раз. Средние и квадратичные отклонения обсчитывали в программе Excel. Для определения достоверности различий применяли критерий Стьюдента. Достоверными считали различия с p < 0,05.

Формирование неприкрепленных автоагрегатов патогенными бактериями

В работе использовали 4 штамма патогенных бактерий, включая грамположительные S. aureus и L. monocytogenes и грамотрицательные P. aeruginosa и E. coli O157:H7. Согласно ранее полученным с E. coli данным, после помещения равномерной суспензии в биоассемблер видимые агрегаты в центре рабочего объема появляются в течение 12–24 часов [6]. Действительно, спустя 24 часа все протестированные штаммы собрались в центре рабочего объема (рис. 1). Продолжение инкубации в течение дополнительных 48 часов не изменяло внешний вид автоагрегатов.

Для того чтобы проанализировать жизнеспособность бактерий в автоагрегатах, проводили окраску автоагрегатов дифференциальным красителем Filmtracer™ LIVE/DEAD™ Biofilm Viability Kit (рис. 2). Окраска дифференциальным красителем показала, что процент живых бактерий в автоагрегатах составлял от 82 (E. coli) до 99% (L. monocytogenes).

Для характеристики относительного количества живых бактерий в автоагрегате и вне его были сделаны высевы разведений суспензии, полученной из автоагрегата, сформированного E. coli (рис. 3). Согласно высевам, количество живых бактерий в агрегате составляло 1,2 × 108 КОЕ, а в среде – 0,7 × 108 КОЕ.

Увеличенная продукция курлей увеличивает эффективность формирования неприкрепленных автоагрегатов E. coli

Мы поставили задачу на основе штамма E. coli O157:Н7 ATCC43890 отобрать продуцирующий курли, но не формирующий биопленки мутант. Неспособность формировать биопленки мутантом необходима была для выявления механизмов, влияющих на формирование агрегатов, но не биопленок. С целью получения такого мутанта разведения ночной культуры высевали на питательный агар, содержащий конго красный и отбирали красные колонии среди белых колоний родительского штамма, не продуцирующего курли. Красные колонии отбирались с частотой 2 на 1000 белых колоний. 4 из 16 отобранных колоний сохраняли красный цвет при последовательных пересевах (рис. 4). Ни один из отобранных мутантов не формировал биопленки так же, как и родительский штамм ATCC43890 (данные не показаны). В дальнейших экспериментах был использован один из 4 отобранных мутантов.

Мутантный и родительский штаммы были выращены в биоассемблере. Для оценки продукции курлей при формировании автоагрегатов использовали конго красный, который был добавлен в среду роста (см. материалы и методы). Связанный с агрегатом краситель был затем смыт, и его количество определяли фотометрически. Количество конго красного, связанного агрегатами, сформированными мутантом, превышало количество красителя, связанного агрегатами дикого штамма, в 2,3 раза (рис. 4). Этот результат свидетельствует о том, что при формировании неприкрепленных агрегатов мутантом наблюдалась повышенная продукция курлей.

Увеличенная продукция курлей сопровождалась существенным увеличением доли бактерий в агрегате относительно свободноплавающих бактерий. Если у дикого типа отношение количества бактерий вагрегате и в среде составляло 1,8, то у мутанта это соотношение равнялось 12,1. Таким образом, полученные данные указывают, что увеличение производства курлей увеличивает эффективность формирования автоагрегатов.

Отсутствие внешней опорной поверхности при формировании неприкрепленных агрегатов является важным отличием, указывающим на ограничения существующих моделей биопленок in vitro [10]. Скорее такие автоагрегаты, сформированные одним видом бактерий и не прикрепленные к поверхности, напоминают флокулы, хорошо известные микробиологам, изучающим поведение бактерий в естественных водоемах. Бактериальная флокуляция в объеме жидкости – процесс, типичный для природных водных экосистем, который используется в промышленности для очистки сточных вод и других приложений [11]. Природные флокулы обычно включают несколько/много видов микроорганизмов. Однако структурно неприкрепленные (авто)агрегаты, формируемые патогенными бактериями в организме человека, и поливидовые флокулы природных водоемов имеют характеристики, общие с прикрепленными к поверхности биопленками, являясь трехмерными структурами, включающими бактериальные клетки и внеклеточный матрикс [2]. Как и биопленки, неприкрепленные агрегаты обеспечивают повышенную устойчивость к противомикробным препаратам [5]. С другой стороны, такие особенности, как потребность в бактериальной подвижности, состав матрикса и механизмы регуляции, могут различаться между неприкрепленными агрегатами и классическими биопленками [10].

Для выращивания неприкрепленных бактериальных агрегатов мы использовали ранее описанную систему магнитов, названную биоассемблер [6][8]. Магнитное поле в этой системе уменьшается к центру рабочего объема, что оказывает эффект на диамагнитные объекты, такие как бактерии, перемещая их в направлении уменьшения поля и обеспечивая концентрацию в центре рабочего объема. В большинстве аналогичных используемых систем магнитной левитации магниты разнесены в пространстве, что определяет альтернативную конфигурацию градиента магнитного поля, которая не собирает клетки в центре объеме, а, напротив, позволяет им разделиться в соответствии с их плавучестью [12].

Биоассемблер включал два специально сконфигурированных постоянных магнита из сплава NdFeB (неодим-железо-бор). Неодимовые магниты, хотя и самые сильные среди постоянных магнитов, не позволяют получить значения плотности магнитного потока выше 2 Т и сами по себе не могут создать магнитную силу, достаточную для магнитной левитации [8]. Проблема магнитной левитации с использованием относительно слабых магнитных полей, создаваемых постоянными магнитами, была ранее успешно решена путем включения в состав питательных сред парамагнитных или супермагнитных жидкостей [6][8]. В данной работе мы использовали раствор гадобутрола – комплексного соединения редкоземельного элемента гадолиния. Гадобутрол под торговой маркой Гадовист® и другими используется при проведении МРТ, и его низкая токсичность была неоднократно протестирована [8].

Нашей целью было использование разработанной системы для анализа регуляторных механизмов, контролирующих формирование автоагрегатов патогенными бактериями. В частности, нас интересовало, как будут влиять на формирование автоагрегатов мутации, влияющие на выработку курлей, поверхностных структур, состоящих из амилоидных белков и играющих важную роль в формировании биопленокE. coli [1].

Токсинпродуцирующие E. coli, относящиеся к серотипу О157:Н7, не формируют биопленки и не продуцируют курли. Это связано с тем, что кодирующий Шига-подобный токсин stx1профаг расположен в кодирующей области гена mlrA, нарушая тем самым продукцию регуляторного белка [13]. Однако неоднократно было показано, что E. coli O157:H7 с высокой частотой выщепляют мутации, приводящие к продукции курлей [13][14]. Некоторые из этих мутаций связаны с утратой профага, и тогда полностью восстанавливается не только продукция курлей, но и способность штамма формировать биопленки [13]. В других случаях мутант получает способность продуцировать курли, но биопленки не формирует, что обычно связано с мутациями в альтернативных частях генома [14].

Полученные в данной работе данные указывают на то, что курли влияют на формирование неприкрепленных автоагрегатов E. coli O157:H7; а также что увеличение производства курлей, не влияющее на способность E. coli O157:H7 формировать биопленки, увеличивает эффективность формирования автоагрегатов. Эти результаты подтверждают ранее сделанные нами выводы о том, что способность формировать биопленки и способность формировать неприкрепленные автоагрегаты у E. coli регулируются независимо [6], хотя с большой вероятностью можно утверждать, что контролирующие эти процессы регуляторные пути пересекаются. На последнее указывает то, что курли, вовлеченные в формирование неприкрепленных агрегатов, также являются существенным элементом биопленок, формируемых штаммами других серотипов E. coli, а также S. typhimurium.

Приведенные результаты показывают, что использованная нами система позволяет получить левитирующие в объеме жидкости неприкрепленные автоагрегаты, сформированные как грамотрицательными, таки грамположительными бактериями. Бактерии, находясь в составе агрегатов, длительное время сохраняют жизнеспособность. Используя разработанную систему и модель энтеропатогенной E. coli O157:H7, мы показали, что автоагрегаты E. coli включают амилоидные белки курлей, а мутации, влияющие на производство курлей, влияют на эффективность формирования автоагрегатов. Описанный метод создания автоагрегатов, не прикрепленных к поверхности, вместе с предложенными количественными методами может быть использован в будущем для исследования механизмов автоагрегации и флокуляции бактерий.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: научное исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения России, тема № 056-00093-22-04 «Разработка тест-системы для экспресс-определения антибиотикорезистентности патогенных бактерий на основе in situ анализа подвижности бактериальных клеток».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – САЕ

Сбор и обработка материала – ПАД, АЕЗ, ДТР

Статистическая обработка – ПАД

Написание текста – САЕ

Редактирование – ПАД