Исследовались следующие виды синтетической биокерамики: 1) керамика некомпозитная на основе волластонита (CaSiO3); 2) керамика композитная на основе волластонита в составе с ГАП (CaSiO3-ГАП); 3) керамика некомпозитная на основе диоксида циркония Zr2O; 4) керамика на основе диоксида циркония в составе с ГАП 15 масс. % (ZrO2-(15 масс. % ГАП); 5) керамика на основе диоксида циркония в составе с (ZrO2-(50 масс. % ГАП). Образцы были изготовлены согласно оригинальным авторским методам, описанным и изученным в работах [9][10].

Образцы имели цилиндрическую форму диаметром 15,3 мм и высотой 4–5 мм.

Для оценки интенсивности формирования бактериальной биопленки на образцах использовали P. aeruginosa и A. baumannii, штаммы получены и идентифицированы в бактериологической лаборатории многопрофильного стационара, г. Владивосток.

Бактериальные биопленки на исследуемых образцах получали двумя способами: 1) образцы помещали в жидкую питательную среду (МПБ, Оболенск, Россия) с P. aeruginosa или A. baumannii (0,5 стандартMcFarland). Культивирование проводили при 37 °С в течение 24 и 48 часов; 2) образцы окунали в жидкую питательную среду (МПБ, Оболенск, Россия) с P. aeruginosa или A. baumannii (0,5 стандарт McFarland) на 10 минут, после этого их размещали в чашках Петри на поверхности 5% кровяного агара, засеянного этими же микроорганизмами. Культивирование проводили при 37 °С в течение 24 и 48 часов.

Фиксация биопленки на образцах проводилась путем промывки в 4% формальдегиде с 1% раствором фосфатного буфера и последующим воздействием 1% раствором осмия тетраоксида в течение 1 часа. Обезвоживание проводили с помощью последовательной обработки в этаноле различной концентрации и при соответствующей экспозиции (30% – 10 минут; 50% – 10 минут; 70% – 10 минут; 96% – 10 минут; 100% – 20 минут), а затем в ацетоне 20 минут.

Морфологию сформированных биопленок изучали с помощью растровой электронной микроскопии (РЭМ) на приборе Carl Zeiss Ultra 55 (Германия) c катодом на полевой эмиссии при ускоряющих напряжениях 1–5 kV и токе пучка I ≈ 100 pA.

Определение процента заселенности бактериями поверхности исследуемых керамик производилось с помощью метода анализа РЭМ-изображений. Использовался классификатор на основе локального бинарного паттерна (Local Binary Pattern, LBP), который задает представление одного пикселя через сравнение с 8 его соседями по яркости. Имеется черно-белое изображение, где каждый пиксель характеризуется тройкой чисел, определяющих оттенок серого цвета. Если центральный пиксель характеризуется меньшей яркостью, чем сосед, то данной ячейке присваивается 1, в противном случае – 0. Затем последовательность единиц и нулей объединяется в бинарное число, которое ставится в соответствие центральному пикселю (рис. 1). Таким образом, на первом этапе каждому пикселю рассматриваемого изображения ставилось в соответствие 8-значное бинарное число. На следующем этапе производилось обучение модели посредством выделения областей, соответствующих одному из 3 типов текстур: «образец», «бактерия», «пора». В рамках обучения частоты каждого значения LBP, изначально равные нулю для каждой текстуры, повышались на 1, если они попали в выделенную область. Затем частоты нормализовались и окончательно получали для каждого значения LBP вероятности быть принадлежным к определенному типу текстур. Далее осуществлялась текстуризация изображения случайным образом с вероятностью, пропорциональной частоте текстуры для значения LBP рассматриваемого пикселя. В результате получалась грубая текстурированная фотография. После этого для каждого пикселя определялось число соседей, принадлежащих определенной текстуре, и, в случае преобладания определенного типа, рассматриваемый пиксель присваивался к новой текстуре, в противном случае оставлялось без изменений. Последняя процедура повторялась до достижения равновесной текстуризации. Процент заселенности бактериями поверхности определялся по отношению числа пикселей, принадлежащих текстуре «бактерия», к общему числу пикселей.

Описанная процедура применялась на 10 РЭМ-изображениях, полученных для каждого из образцов керамики, причем обучение модели проводилось на одной из фотографий и повторялось заново при переходе к другой керамике.

При исследовании выявлена заметная разница в интенсивности формирования и структуре бактериальной биопленки в исследуемых образцах.

На волластонитовой керамике без добавления ГАП (рис. 2а, а*) преимущественно наблюдаются отдельно расположенные бактериальные клетки. Присутствуют отдельные и редко сосредоточенные по поверхности образцов небольшие плотные участки сформированной биопленки. Бактерии (как отдельные, так и в составе биопленки) покрыты плотным слоем внеклеточного полимерного матрикса, защищающего их от воздействия негативных факторов окружающей среды.

На керамике композитного состава CaSiO3-ГАП (рис. 2б, б*) слой бактериальной биопленки гораздо более выражен. Он толстый и объемный, содержит большое количество матрикса, хорошо видны F-пили (обозначены на рис. 2б* стрелками). Слой представляется достаточно толстым и объемным за счет структуры матрикса и отпочковывающихся планктонных форм бактерий (рис. 3), что является признаком зрелости биопленки и активности ее распространения, а также косвенным подтверждением повышенной биосовместимости данного образца по сравнению с керамикой, не содержащей ГАП.

На образцах 3, 4 и 5 (на основе оксида циркония) отчетливо видна зрелая сформированная биопленка, однако процесс ее формирования, по всей видимости, зависел от состава исследуемых образцов (рис. 4).

Интенсивность формирования биопленки (процент покрытия поверхности исследуемых керамик), определенная с помощью классификатора на основе локального бинарного паттерна, была следующая: керамика ZrO2 без ГАП – 28,13%, ZrO2 + 15 масс. % ГАП – 28,33%, ZrO2 + 50 масс. % ГАП – 88,46%.

В составе биопленок на всех образцах хорошо выражен внеклеточный полимерный матрикс, который покрывает и окружает бактериальные клетки. Он обеспечивает защиту бактерий от воздействия негативных факторов окружающей среды, препятствует проникновению антибиотиков, а в условиях живого организма защищает от факторов иммунной системы.

На образцах без ГАП и с 15 масс. % ГАП биопленка формируется менее интенсивно. Она гораздо более тонкая, бактериальный слой не сплошной, видны «просветы» в матриксе, он представляется более рыхлым (рис. 4 а, б).

На образце с 50 масс. % добавкой ГАП биопленка сформирована наиболее интенсивно, покрывает поверхность образца толстым слоем (рис. 4 в, в*).

Для оценки интенсивности формирования бактериальной биопленки на материалах, используемых в ортопедической хирургии, нами предложено использовать одни из ключевых возбудителей ИСМП –P. aeruginosa и A. baumannii. Это неферментирующие грамнегативные бактерии, широко распространенные в окружающей среде, хорошо сохраняющиеся и размножающиеся, в том числе и в госпитальных условиях. Они имеют широкий спектр факторов вирулентности, которые обеспечивают способность к инвазии и персистенции в тканях, цитотоксическому эффекту, стимуляции генерализованной воспалительной реакции и очень быстро формируют биопленки [11]. Помимо локализации на слизистых оболочках и коже пациентов они обладают выраженной адгезивной способностью к имплантируемым устройствам (катетеры, эндотрахеальные трубки, дренажи и др.). Частота ИСМП, вызываемых P. aeruginosa, составляет до 30% [12], а A. baumannii – до 10% [13], и она постоянно растет. Это наиболее актуальные возбудители всех ИСМП, кроме ангиогенных [14][15].

Данное исследование направлено на расширение списка материалов, отвечающих различным задачам современной медицины и максимально удовлетворяющих требованиям конкретного клинического случая. Изучались различные виды искусственных материалов, создаваемых и используемых для применения в ортопедической хирургии в качестве замены натуральной кости.

В результате проведенного исследования отмечено, что наличие ГАП в составе композитной биокерамики повышает интенсивность формирования бактериальных пленок на поверхности образца. Более толстая и активно формирующаяся биопленка косвенно свидетельствует о более высокой биосовместимости таких материалов с тканями пациента. Однако следует учитывать, что при этом также возрастает риск развития инфекционного процесса, что требует дополнительной процедуры противобактериальной обработки или повышении антибактериальных свойств изделий из таких композитных материалов.

С точки зрения оценки риска возникновения инфекционного процесса при применении такого вида материалов для замещения дефектов костной ткани, на данном этапе наиболее оптимальным является керамика на основе диоксида циркония с добавкой 15 масс. % ГАП.

Данное исследование процесса формирования и структуры биопленок на синтетических биокерамических материалах, используемых для создания костных имплантатов, которые широко применяются вортопедической хирургии и стоматологии, показало, что наиболее оптимальным вариантом среди исследуемых образцов является биокерамика с добавлением гидроксиапатита не более 15 масс. %. При увеличении количества гидроксиапатита в составе биокерамики возрастает риск развития инфекционного процесса, что требует дополнительной процедуры антибактериальной обработки или повышения антибактериальных свойств изделий из таких композитных материалов. Таким образом, изучение процесса формирования и структуры биопленок – важный раздел дальнейшей работы по разработке оптимального состава биокерамики для создания костных имплантатов.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: исследование по синтезу биоматериалов выполнено в рамках проекта Российского научного фонда №18-73-10107.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: ЮЕС, ПЕК

Сбор и обработка материала: ЮЕС, ПЕК, ШОО

Написание текста: ЮЕС, ПЕК, ЗЕА

Редактирование: ЗЕА.