В исследование были включены мужчины репродуктивного возраста (20–45 лет) с хроническим бактериальным простатитом (ХБП), находящиеся на амбулаторном лечении в отделении охраны репродуктивного здоровья Оренбургского перинатального центра ГАУЗ «ООКБ № 2». Алгоритм обследования пациентов включал сбор анамнеза, оценку жалоб, физикальные методы, в том числе трансректальное УЗИ и пальцевое ректальное исследование предстательной железы (ПЖ). Также проводили анкетирование с помощью шкалы оценки симптомов ХБП Национального института здоровья США (NIH-CPSI) и международного индекса эректильной функции (IIEF-5).

Критерии постановки диагноза ХБП и включения пациентов в исследование: 1. Клинические признаки (один или несколько); боли различной локализации (в промежности, мошонке, крестце, паховой области и т. д.); расстройство мочеиспускания (учащенное мочеиспускание, вялая или прерывистая струя мочи, чувство неполного опорожнения мочевого пузыря, боль во время мочеиспускания); нарушение эякуляции (преждевременная эякуляция, боли при и после эякуляции, гемоспермия). 2. Увеличение количества лейкоцитов в секрете ПЖ (более 10–15 в поле зрения) или в моче, полученной после массажа ПЖ. 3. Культуральное подтверждение возбудителя ХБП. 4. Длительность заболевания не менее года. 5. Возраст 20–45 лет.

Пациенты с инфекциями, передаваемыми половым путем, были исключены из исследования. До включения в работу у всех участников научного исследования было получено письменное информированное согласие. Протокол исследования утвержден на заседании локального комитета по биоэтике Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (протокол № 2 от 27.04.2021 г.). При обследовании пациентов соблюдены акты национального стандарта РФ ГОСТ Р 52379-2005 о надлежащей клинической практике [5]. Секрет простаты после массажа предстательной железы (ПЖ) собирали в стерильные емкости и доставляли в лабораторию в течение 10–15 минут. Выделение бактерий из исследуемого материала проводили общепринятыми методами бактериологического исследования: засевали на поверхности кровяного и желточно-солевого агара методом секторных посевов и инкубировали при 37 °С в течение 18–24 часов.

Видовую принадлежность микроорганизмов оценивали с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия), идентификацию микроорганизмов с расчетом коэффициента достоверности проводили с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.

Антилизоцимную активность микроорганизмов (АЛА) определяли фотометрическим методом [6], способность образовывать биопленки (БПО) – по методике [7], показатель адгезии микробных клеток (ПА) – по [8], гемолитическую активность (ГА) – по [9]. Адгезивные свойства бактерий в отношении эритроцитов оценивались исходя из следующих критериев: при ПА свыше 40% – высокий уровень адгезивной активности, при ПА от 15 до 40% – средний, при ПА от 5 до 15% – низкий, при ПА менее 5% степень адгезии бактерий считали нулевой.

Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 30 штаммов стафилококков, из них: 12 – Staphylococcus aureus и 18 коагулазонегативных стафилококков (CNS) разных видов – S. epidermidis,S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus.

Бактериальную дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагировали с помощью реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Циклический синтез фрагментов ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Для определения наличия генов резистентности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры [10][11], синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (табл. 1).

Ген bap кодирует белок, ассоциированный с биопленками; ica A и ica D – полисахарид межклеточной адгезии; eno – ламининсвязывающий белок; clf A и clf B – факторы слипания А и В (клампинг-факторы – Clf A Clf В); fnb A и fnb B – фибронектинсвязывающие белки А и В; fib – фибриногенсвязывающие белки.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе: 1 цикл денатурации ДНК при 94 °С (5 мин), затем 30–35 циклов амплификации (денатурация ДНК – 95 °С (30 сек), отжиг праймеров – 47–56 °С (30 сек) и стадию элонгации – 72 °С (45 сек) и 1 цикл завершения амплификации – 72 °С (10 мин).

Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, ТАЕ буферной системе с использованием стандартных наборов фирмы «ИнтерЛабСервис». В качестве маркеров использовали маркер длин ДНК 100+ bp DNA Ladder (ЕвроГен). Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс.

Статистический анализ результатов проводился с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007. Значимость различия средних величин оценивали с помощью методов вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента, статистически значимыми отличиями показателей считали при значениях p < 0,05.

При бактериологическом исследовании секрета простаты стафилококки выделяли в 69,8% случаев. При этом в монокультуре они обнаружены в 43,3%, в ассоциациях с E. faecalis – в 33,2%, ассоциации разных видов стафилококков составляли 23,2%. Монокультуры были представлены S. aureus и разными видами коагулазоотрицательных стафилококков (CNS): S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus. В двухкомпонентных ассоциациях S. warneri выделялся совместно с S. epidermidis и S. haemolyticus. Обсемененность секрета простаты составляла в среднем 5×104 КОЕ/мл.

У выделенных штаммов стафилококков разных видов определен комплекс биологических свойств (биопрофили), включающий их вирулентные и персистентные характеристики (рис. 1).

Анализ особенностей биопрофилей стафилококков показал широкую распространенность гемолитической активности как у золотистых стафилококков, так и у CNS (77,8 ± 12,8% и 100%), при этом выраженность ГА у золотистых стафилококков в 1,8 раза превышала данный показатель у CNS (63,5 ± 7,1 и 35,8 ± 2,5% соответственно, p < 0,01). Коагулазонегативные стафилококки чаще чем S. aureus проявляли антилизоцимную активность (77,8 ± 9,8 против 52,7 ± 13,7%) с достоверно более высокими значениями признака (1,00 ± 0,15 мкг/мл и 0,51 ± 0,13 мкг/мл, p < 0,05). Способностью образовывать биопленки обладали все изученные изоляты золотистого стафилококка и 66,7 ± 11,1% штаммов CNS, а экспрессия признака у первых составляла 1,79 ± 0,10 у. е., у вторых – 1,33 ± 0,06 у. е. (p < 0,05). Способностью к адгезии обладали все изученные штаммы стафилококков, однако отмечены существенные различия в экспрессии признака у штаммов бактерий разной видовой принадлежности. Показатель адгезии у S. aureus составлял 54,1 ± 0,51%, а у CNS – 28,0 ± 0,36% (p < 0,01). При этом среди S. aureus показатель адгезии изменялся от 38 до 75%, с преобладанием высоко адгезивных штаммов (92%). Среди CNS были выявлены как низкоадгезивные (33%), так и штаммы со средним (45%) ивысоким уровнем ПА (22%).

Кроме того, у стафилококков было изучено наличие генетических детерминант патогенности. Полученные результаты свидетельствовали о вариабельности частоты встречаемости изученных генов у штаммов стафилококков разных видов (табл. 2), при этом генетические детерминанты патогенности eno, ica D, ica А выявлены у изолятов всех изученных видов, а гены fnb A, fnb В, clf A, clf B, fib – только у культур S. aureus. Ген bap у изученных штаммов не обнаружен.

У всех изолятов стафилококков обнаружен ген eno, установлено его изолированное присутствие у штаммов S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, а также в разных комбинациях с другими генами у изолятов S. aureus, S. epidermidis и S. warneri.

Сочетание двух генов зафиксировано у всех штаммов S. warneri (eno, ica D) и 75% культур S. epidermidis (eno, ica А). У изолятов S. aureus отмечены следующие сочетания трех и четырех генов: eno, ica D,fnb A; eno, ica А, ica D, fnb A соответственно. Половина культур S. aureus характеризовалась наличием комплекса из 6 генов патогенности (eno, ica D, fnb A, clf A, clf B, fib), у 25% штаммов золотистого стафилококка зарегистрировано 7 генов, детерминирующих факторы патогенности (eno, ica А, ica D, fnb A, clf A, clf B, fib).

Анализ биопрофилей стафилококков, выделенных из секрета простаты у больных ХБП, показал, что данные микроорганизмы вне зависимости от их таксономической принадлежности (S. aureus или CNS) характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и персистентных свойств, включая адгезивную, гемолитическую, антилизоцимную активность и способность к образованию биопленок.

Наличие у изученных нами золотистых стафилококков выраженной способности к адгезии, а также обнаружение у них генов, детерминирующих белки, способные связываться с некоторыми поверхностными белками эукариотических клеток (ламинином, фибронектином, фибриногеном) в конечном счете могут привести к формированию восходящей инфекции из уретры с последующей колонизацией тканей предстательной железы. Отмеченное нами существенное отличие генов, кодирующих адгезию, у штаммов S. aureus, подтверждает разницу между этим и другими видами стафилококков, что ранее было продемонстрировано при анализе у них вирулентных и персистентных характеристик на фенотипическом уровне [12].

Важными патогенными факторами бактерий являются токсины, повреждающие клетки хозяина и нарушающие их метаболизм, что делает среду биотопа более благоприятной для стафилококков. Таким секретируемым фактором вирулентности является α-гемолизин, относящийся к порообразующим токсинам, лизирующим эритроциты и ядросодержащие клетки, который выявлен нами у большинства изолятов стафилококков, при этом выраженность признака была выше у штаммов S. aureus.

Экспрессия микроорганизмами указанных патогенных признаков, очевидно, обеспечивает развитие инфекционно-воспалительного заболевания, а длительному переживанию возбудителя в организме способствуют персистентные характеристики стафилококков [13], в частности их адгезивность, биопленкообразование и антилизоцимная активность. Представляет интерес характеристика генов, участвующих в формировании биопленок. Ранее было показано, что не только S. epidermidis, но и S. aureus характеризуются наличием оперона ica, ответственного за продукцию полисахаридов биопленки [14]. Ген ica D, входящий в состав этого оперона, был обнаружен нами у всех изученных штаммов золотистого стафилококка и 25% штаммов CNS и, напротив, ген ica A зарегистрирован чаще у CNS. Следовательно, разные виды стафилококков различаются по наличию генов, детерминирующих способность образовывать биопленки. Длительному персистированию микроорганизмов при простатите способствует также их способность инактивировать лизоцим [14]. Обнаружение нами антилизоцимной активности более чем у половины штаммов стафилококков указывает на несомненную значимость этого признака в реализации инфекционного процесса и подтверждается результатами других авторов [15].

Патогенные фено- и генопрофили микроорганизмов, выделенных при ХБП, могут использоваться, с одной стороны, в качестве критерия для поиска и идентификации возбудителя, а с другой – для разработки эффективных подходов к терапии пациентов с указанной патологией.

Установлено, что золотистые стафилококки характеризуются более высокими значениями ПА, ГА и БПО по сравнению с коагулазонегативными стафилококками, тогда как у последних выше экспрессия АЛА. Отмечено существенное отличие генов, детерминирующих адгезию и способность образовывать биопленки, у штаммов S. aureus по сравнению с CNS.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: исследования были проведены в рамках госзадания FUUG–2022-0007 «Исследование симбиотических систем про- и эукариот в биологии и медицине».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – КОЛ, ПОА, ПТМ

Сбор и обработка материала – МСВ, ПОА, ПТМ

Статистическая обработка – ПОА

Написание текста – КОЛ, ПОА, ВАГ

Редактирование – КОЛ, ПОА, ПТМ, ВАГ