Исследование одобрено Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 3 от 20 ноября 2017 г.).

Клинические изоляты E. faecalis (n = 51) были выделены из мочи детей в возрасте от 3 дней до 17 лет, находившихся на лечении по поводу инфекции мочевыделительной системы в ГБУЗ «Краевая детская клиническая больница № 1» (г. Владивосток) в период с 2013 по 2017 г. Штаммы уропатогенных фекальных энтерококков были охарактеризованы нами ранее с помощью микробиологического и молекулярно-генетического методов [2][9][10][11].

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с применением программного обеспечения Statistica 13 (StatSoft, Inc., США) и Excel (Microsoft Office 2010). Различия частоты встречаемости признаков в группах были подтверждены с помощью непараметрических методов (критерия χ2 Пирсона; точного критерия Фишера).

E. faecalis, выделенные из мочи детей с ИМС, показывают фенотипические особенности микробиологических свойств: проявляют вариабельность ферментативной активности в отношении ряда углеводов, факторов патогенности и антибиотикорезистентности [2][9][10][11].

Статистическими методами определены прямые и обратные связи фенотипических проявлений факторов патогенности E. faecalis между собой, биохимической активностью и антибиотикорезистентностью (рис. 1).

С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) коллекция изучаемых E. faecalis была протестирована на наличие наиболее изученных генов, кодирующих белки, участвующие на разных этапах инфекционного процесса (кодирующих адгезию и инвазию (aggA, esp, efaA), синтез желатиназы (gelE), активатор цитолизина (cylA) и усилитель экспрессии феромона (esp)) и антибиотикорезистентности aac(6’)–Ie–aph(2”)–Ia (высокий уровень резистентности к гентамицину), ant(6’)–Ia (высокий уровень резистентности к стрептомицину), tetL (резистентность к тетрациклину), tetM (резистентность к тетрациклину и миноциклину), ermB (высокий уровень устойчивости к 14-, 15- и 16-членным макролидам, линкозамидам и стрептограмину В) [11].

С использованием статистических методов анализа были установлены значимые связи между наличием генов патогенности, антибиотикорезистентности и фенотипическими проявлениями биологических свойств у мочевых изолятов Е. faecalis (рис. 2).

По результатам оценки особенностей фенотипических проявлений микробиологических свойств и наличием определенного гена изучаемые энтерококки были распределены на три группы. В первую группу вошли Е. faecalis (n = 22), ферментирующие лактозу и маннит (100%), не разлагающие рамнозу (100%), проявляющие гемолитическую активность (ß-типа). Энтерококки данной группы (72,7%) проявляли резистентность только к одному классу антибактериальных препаратов (АБП) или были чувствительны к изучаемым антибактериальным препаратам, несли cylA (100%) и esp (81,8%) гены (табл. 1).

Во вторую группу – энтерококки (n = 12), не сбраживающие лактозу (41,7%) и сахарозу (16,7%), обладающие протеолитической (в отношении молока) активностью (100%), резистентные к фторхинолонам II и III поколения (норфлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину) (100%), гентамицину (100%), триметоприму/сульфатометоксазолу (100%), имеющие aggA (100%), gelE (83,3%), aac(6’)–Ie–aph(2»)–Ia(83,3%) гены.

В третью – E. faecalis (n = 17), обладающие различными вариантами встречаемости биохимической активности, факторов патогенности, антибиотикорезистентности и наборами детерминант изучаемых генов.

Выявленная фенотипическая и генетическая неоднородность микробиологических свойств изучаемой коллекции мочевых изолятов энтерококков послужила основой проведения мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) для оценки их этиологической значимости.

По результатам MLST изучаемые E. faecalis распределились по четырнадцати (ST6, ST16, ST21, ST25, ST40, ST41, ST64, ST116, ST133, ST151, ST179, ST774, ST480, ST537) сиквенс-типам, наиболеечасто выявлялись ST179 (n = 13), ST774 (n = 6) и ST6 (n = 5) (рис. 3).

Фекальные энтерококки, разделенные нами по группам, на основе различий микробиологических свойств соотносились с определенными сиквенс-типами (ST). Фекальные энтерококки первой группы, которые обладали гемолитической активностью ß-типа, проявляли резистентность только к одному классу АБП или были чувствительны к изучаемым антибактериальным препаратам (72,7%), несли cylA ген, принадлежали к ST179, ST16 и ST537.

E. faecalis второй группы, обладающие протеолитической активностью, устойчивые к фторхинолонам, гентамицину и триметоприму/сульфаметоксазолу, имеющие aggA ген, отнеслись к ST6 и ST774.

Подтверждение этиологической значимости мочевых изолятов представляет собой большую сложность, особенно при выявлении условно-патогенных энтерококков, из-за наличия большого количества разнообразных факторов агрессии [3][4][7].

Несмотря на широкое изучение факторов патогенности фекальных энтерококков, изолированных при различных патологиях человека [6][7][12], на сегодня не установлены микробиологические критерии для оценки этиологической значимости мочевых изолятов E. faecalis.

Среди наиболее изученных потенциально важных факторов для инициации и хронизации энтерококковой инфекции выделяют субстанцию агрегации (аgg, asa1), гемолизины/цитолизины (cyl), желатиназу (gelE), энтерококковый поверхностный белок (esp), Enterococcus faecalis антиген A (efaA), пили, ассоциированные с развитием эндокардита и образованием биопленки (ebp), антилизоцимную, антикомплементарную активности [2][3][4][5][6][7].

В проведенном нами исследовании были определены фенотипические особенности проявлений биологических свойств фекальных энтерококков, полученных из мочи у детей при ИМС: наличие ферментации маннита, ее отсутствие в отношении рамнозы, наличие/отсутствие ферментации лактозы, наличие/отсутствие гемолитической и протеолитической активностей.

В нашем исследовании впервые установлены корреляционные связи между наличием гена aac(6’)–Ie–aph(2»)–Ia и фенотипическими проявлениями биологических свойств у мочевых изолятов Е. faecalis: обратная – с «выраженной» гемолитической (φ = 0,39; p = 0,006) активностями; прямая – с протеолитической (ферментацией молока (φ = 0,48; p = 0,0001), разжижением желатины (φ = 0,54; p = 0,0001)), липолитической (в отношении лецитина (φ = 0,61; p = 0,0001)) активностями и резистентностью к фторхинолонам II и III поколения (норфлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину) (φ = 0,83, p = 0,0001), триметоприму/сульфаметоксазолу (φ = 0,67, p = 0,0001) и гентамицину (φ = 0,46, p = 0,002) (рис. 2).

Кроме того, выявленное фенотипическое и генетическое разнообразие микробиологических свойств E. faecalis, а также их корреляций между собой удостоверяет, что уропатогенность – это полидетерминированная характеристика, обусловленная комплексом патогенетически значимых факторов [1].

По результатам оценки фенотипических проявлений биологических свойств и наличию определенного гена изучаемые энтерококки были распределены на три группы, отличающиеся различными вариантами встречаемости биохимической активности, факторов патогенности, антибиотикорезистентности и наборами детерминант изучаемых генов. Выявление большого количества факторов патогенности нафенотипическом и генетическом уровнях, способствующих развитию инфекции в уротракте среди мочевых Е. faecalis первой и второй групп, позволяет их рассматривать с позиций этиологически значимых, поэтому в дальнейших исследованиях мы остановились на изучении этих штаммов более подробно. С этой целью было проведено мультилокусное сиквенс-типирование мочевых изолятов E. faecalis, выявившее 14 ST.

Подтверждение этиологической значимости E. faecalis на сегодня может осуществляться с помощью изучения их популяционной структуры [13][14]. Известно, что принадлежность энтерококков к определенным дискретным линиям ассоциируется с повышенной вирулентностью, антибиотикорезистентностью и риском распространения их в больничной среде [13].

Согласно базе данных MLST, в настоящее время для E. faecalis зарегистрировано 1104 сиквенс-типа, с превалированием ST6 среди мочевых изолятов [15]. По данным Zheng J.X. (2018), уропатогенныеE. faecalis в большинстве относятся к ST179 и ST16 [14]. Фекальные энтерококки ST6, ST181 и ST28 сиквенс-типов чаще идентифицируют при нозокомиальных инфекциях [13].

Учитывая, что среди изучаемых мочевых изолятов E. faecalis превалируют определенные сиквенс-типы с характерными проявлениями биологических свойств, способствующих развитию инфекции в уротракте, мы отнесли их к этиологически значимым при ИМС у детей – ST179, ST16, ST537, ST6 и ST774.

Важно отметить, что E. faecalis ST6 и ST774 отличались от ST179, ST16 и ST537 фенотипическими проявлениями микробиологических свойств (обладали протеолитической (в отношении молока) (100%),не показывали гемолитическую активность, были устойчивы к фторхинолонам II и III поколения (норфлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину) (100%), гентамицину (100%) и триметоприму/сульфаметоксазолу (100%)) и отличались генетическими свойствами (имели aggA (100%), aac(6’)–Ie–aph(2»)–Ia (83,3%) гены).

Следует подчеркнуть, что, по данным литературы, продукция энтерококками гистоповреждающих субстанций (протеаз) способствует инициации воспалительной реакции, альтерации тканей, бактериальной инвазии и диссеминации возбудителя [3]. Кроме того, выявленная множественная антибиотикорезистентность энтерококков приводит к селекции высоковирулентных штаммов. Именно такими свойствами характеризовались мочевые Е. faecalis ST6 и ST774 сиквенс-типов.

На основании выявленных связей некоторых биологических свойств мочевых изолятов Е. faecalis с принадлежностью их к определенному сиквенс-типу нами был разработан алгоритм оценки этиологически значимых и высоковирулентных E. faecalis, выделенных из мочи детей с ИМС (рис. 4).

Таким образом, комплексное определение некоторых потенциально важных биологических свойств возбудителя: ферментативной активности, связанной с патогенностью и биохимической активностями, антибиотикорезистентностью не только на фенотипическом, но и на генетическом уровне, позволяет оценить диагностическое значение уроштаммов E. faecalis, выделенных из мочи детей с ИМС, что будет способствовать персонифицированному подходу к лечению данных пациентов.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-315-90036.