Эксперимент проведен на 20 самках белых крыс линии Wistar возрастом 6 мес. и весом 180–200 г, ранее выносивших и выкормивших приплод. Их содержали в стандартных условиях и разделили рандомно поровну на контрольную и подопытную группы, провели синхронизацию эстральных циклов с оценкой вагинальных мазков. В лютеиновую фазу цикла всем крысам выполнили операцию: поясничным доступом в группе опыта провели билатеральную овариэктомию, в группе контроля – разрез без удаления яичников. Устранив эффекты эндогенных овариальных гормонов у крыс подопытной группы, начали моделировать гиперэстрогению ежедневным трансдермальным введением эстрогенов на протяжении 4 недель (аппликации на выбритую кожу живота геля, содержащего эстрадиол 0,1% (1 мг/мл) из расчета дозы 1 мг на 1 кг веса). Через 4 недели животных вывели из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом (контрольную группу вывели из эксперимента в эструсе, для сопоставления гистологических изменений в опыте с параметрами пролиферативного эндометрия циклирующих животных). Методика является авторской (основной разработчик – Н.И. Волоцкая), отработана и описана в данной публикации впервые, релевантность верифицирована морфологически.

Во время эксперимента были соблюдены принципы биоэтики согласно отечественным стандартам и Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для научных целей; получено согласование комитета по этике Института «Медицинская академия имени С.И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского» (Протокол № 4 от 12.04.22 г.).

Преаналитический этап гистологической обработки проводили в соответствии с требованиями молекулярной иммунодиагностики: фиксацию, проводку в гистопроцессоре Logos Millestone (Италия), заключение в парафиновые блоки, изготовление срезов толщиной 4 мкм, окраску гематоксилином и эозином по стандартным методикам. Иммуногистохимическую окраску осуществляли в иммуногистостейнере Bond-MAX (Leica, США) с рекомендованными режимами демаскировки и инкубации (таблица 1), с контрольными образцами. Протокол включал депарафинизацию, блокировку эндогенной пероксидазы, детекцию с Bond Polimer Refine Detection (Leica, Великобритания). Окрашенные срезы сканировали на сканере гистопрепаратов Aperio CS2 (Leica, США) и обрабатывали полученное изображение при помощи программного обеспечения Aperio Image Scope v.11.0.3.

На изображениях гистологических препаратов оценивали высоту эндометрия и просветных эпителиальных клеток, площади желез и стромы. Определяли экспрессию рецепторов к прогестерону и эстрогену (ER, PrR), пролиферативную активность клеток эндометрия (Ki67), состояние систем апоптоза с антителами (СD95, bcl-2), активность ангиогенеза (VEGF), а также воспаления (CD4, CD8, CD138, CD20) (табл. 1). Использовали систему детекции Bond Polymer Refine Detection System (Leica, Великобритания).

Для маркеров bcl-2, CD95, VEGF, ER, PrR, Ki67 на увеличении в 20 крат исследовали 10 полей зрения. Интенсивность окрашивания оценивали в баллах по шкале: 0 – отсутствие реакции, 1+ 0–25%, 2+ 25–75% и 3+ – более 75% позитивно окрашенных клеток. Отдельно оценивали экспрессию маркеров в строме эндометрия и в железистых клетках. Для маркеров CD4, CD8, CD20, CD138 подсчитывали количество клеток с позитивной реакцией на 1 мм² среза в 10 полях зрения. Оценивали экспрессию белков дифференцировано в доминантном правом роге матки (аналог тела матки человека – место плацентации и вынашивания потомства у многоплодных животных) и теле матки (аналог шейки матки человека – часть, предназначенная для проникновения спермы и изгнания плодов, активнее контактирующая с внешней средой).

Статистическую обработку данных выполнили с использованием пакета программ Statistica 10.0 Stat Soft после оценки нормальности распределения признака выборки по методу Шапиро – Уилка. Для определения различий между основной и контрольной группами применяли метод Манна – Уитни. Для выявления корреляции между экспрессией различных маркеров использовали метод Спирмена. Поскольку распределение значений признаков отличалось от нормального либо имело категориальный дискретный характер, данные представлены как Me [Q1; Q3].

Исследования выполнены в Центральной научно-исследовательской лаборатории и виварии ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», подтвердившего приемлемость содержания и использования животных с биоэтических позиций.

В группе животных с моделью гиперплазии эндометрия морфометрически выявлен прирост железистого компонента, что существенно изменило железисто-стромальное отношение в сравнении с контрольной группой (рис. 1). Одновременно было обнаружено увеличение высоты железистых клеток как в железах, так и в покровном эпителии просвета рога матки. Высота эпителиальных клеток составила 42,3 ± 9,6 мкм, что в два раза превышает подобный показатель в контрольной группе (21,4 ± 4,1 мкм). Такая морфологическая картина подтверждает эффективность предложенной нами модели ГЭ, при которой используется трансдермальное введение гормонов при условии элиминации естественного гормонального фона путем овариоэктомии.

Результаты ИГХ анализа показали разнонаправленную динамику рецепторных нарушений при гиперэстрогении (табл. 2). Экспрессия рецепторов к прогестерону стабильно низкая во всех отделах матки у крыс всех групп, а к эстрогену – на модели ГЭ достоверно снижена в роге матки, что может быть вызвано активацией внутриклеточных систем ауторегуляции при избытке эстрогенов, при этом в аналоге шейки матки таких компенсаторных изменений нет.

По выраженности экспрессии маркера VEGF, в виде цитоплазматического окрашивание железистого эпителия и клетках стромы эндометрия, отличий между группами нет: в клетках стромы и в железах эндометрия всех групп наблюдается интенсивное цитоплазматическое окрашивание, что свидетельствует о сохранности регуляции ангиогенеза в условиях гормонального дисбаланса.

Маркеры пролиферации и апоптоза не одинаково экспрессируются в тканях крыс контрольной группы и группы с моделью эстрогении. В модели ГЭ экспрессия СD95 оказалась стабильно высокой как в стромальных клетках, так и в эпителиальных клетках железистых структур во всех отделах матки по сравнению с конт­ролем. Последнее может свидетельствовать об активации внешнего пути апоптоза как компенсаторного процесса нарушенной кинетики клеточной популяции эндометрия в условиях гиперэстрогении. Экспрессия антиапоптотического белка bcl-2 отрицательная во всех группах. Положительная реакция выявлена лишь в лимфоцитах, что служит контролем протокола. Экспрессия Ki-67 умеренная в строме рога матки крыс контрольной группы и не имеет динамики в группах с ГЭ, но негативная в строме тела матки в контроле. Модель ГЭ увеличивает его экспрессию в теле матки.

При оценке числа лимфоцитов разных популяций в строме рога и тела матки при ГЭ выявлена интересная динамика: в тканях крыс контрольной группы лимфоциты CD138, CD20, CD4 и CD8 представлены относительно равным числом клеток, а в модели ГЭ самыми малочисленными оказались CD138+ клетки в роге и CD8+ в теле (табл. 3), что говорит об ингибировании плазмоцитов и Т-лимфоцитов в иммунном ответе этих тканевых зон на фоне ГЭ (рис. 2).

При корреляционном анализе по методу Спирмена выявлена положительная связь между экспрессией рецепторов эстрогена и пролиферативной активностью эпителиальных клеток желез рога матки. Также выявлена сильная положительная корреляция между количеством CD4+, СD8+ и CD138+ лимфоцитов в строме рогов и тела матки внутри групп. Это указывает на комплексные взаимосвязанные эффекты ГЭ.

Отмечена специфика динамики маркеров в зонах тела и рога матки экспериментальных животных. Общей тенденцией изменений в обоих отделах является активация маркеров апоптоза. При этом количество рецепторов эстрогенов в роге при ГЭ снижается, что может быть связано с компенсаторным ингибированием экспрессии рецепторов избытком экзогенного эстрогена. Кроме того, и в теле, и в роге матки отмечено снижение Т- и В-лимфоцитов. По-видимому, от уровня эстрогеновых рецепторов может зависеть активность процессов пролиферации. Так, в роге матки активность маркера Ki-67 имеет тенденцию к снижению, а в теле матки к некоторому увеличению.

При проведении клинических исследований было показано, что на фоне гиперэстрогении хроническое воспаление постепенно становится лидирующим патогенетическим фактором [3][4]. В экспериментальных исследованиях на животных моделирование гиперэстрогении проявлялось в большей степени морфологической трансформацией тканей эндометрия, обусловленной изменением баланса процессов пролиферации и апоптоза. Причем мы не обнаружили увеличения лимфоцитарных маркеров в тканях гиперплазированного эндометрия у крыс, что может быть следствием недостаточного временного фактора в формировании гиперплазии или свидетельствовать о малой активности лимфоцитарных механизмов в возможном формировании воспалительных изменений.

Описанные патологические закономерности ГЭ требуют дальнейшего изучения, однако все они созвучны теории Д. Ханахана и Р. Вайнберга Hallmarks of Cancer, выделяющей в обзоре 2022 года уже 14 маркеров трансформации клеточных популяций [15]. В проведенном исследовании при формировании экспериментальной гиперплазии эндометрия показана тенденция к активной пролиферации эндометрия и потери надзора ткани эндометрия со стороны иммунной системы. Данные изменения могут способствовать дальнейшим процессам прогрессирования гиперплазии и возможной малигнизации эндометрия с усилением ангиогенеза, формированием геномной нестабильности и фенотипической пластичности.

На модели ГЭ у крыс после овариоэктомии и транс­дермального введения эстрогенов выявлен прирост железистого компонента с гистологической и морфометрической верификацией, в связи с чем можно рекомендовать модель в экспериментальные работы. На модели ГЭ установлено изменение иммунофенотипического профиля: снижение экспрессии рецепторов к эстрогену в роге матки, увеличение активности митоза в эпителиоцитах тела матки, активация внешнего пути апоптоза клеток во всех отделах матки, снижение экспрессии маркеров плазмоцитов (CD138) в строме всех отделов матки и Т-лимфоцитов (CD8) в строме тела матки. Таким образом, можно заключить, что при гиперплазии эндометрия на фоне гиперэстрогении структурные изменения обусловлены дисрегуляцией клеточного цикла; при этом внутриклеточные системы ауторегуляции более эффективны в роге матки по сравнению с телом матки, поскольку нет изменения экспрессии рецепторов к эстрогену и повышена митотическая активность клеток; учитывая дефицит иммунокомпетентных Т-клеток, в этой зоне возрастает риск тканевой и клеточной трансформации. Эти данные перспективны для дальнейшей разработки разных направлений патогенетической терапии и оценки эффективности на приведенной модели.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: работа финансово поддержана государственным заданием No FZEG-2020-0060 Минобрнауки России в сфере научной деятельности «Алгоритмы молекулярно-генетической диагностики злокачественных новообразований и подходы к их таргетной терапии с применением клеточных и генетических технологий».

Участие авторов:

Разработка концепции и дизайна – КАВ, ВНИ, ПНС

Анализ и интерпретация данных – КМА, МТП

Обоснование рукописи – ПГИ

Окончательное утверждение для публикации рукописи – КЕП, ЗЕЮ