Материалом послужили 174 штамма P. aeruginosa, выделенные у пациентов многопрофильного стационара г. Владивостока в 2012 (55 штаммов), 2019 (55 штаммов) и 2023 году (64 штамма).

В качестве маркеров генотипов был выбран ряд генов, кодирующих важные факторы антибиотикорезистентности. Для молекулярно-генетического анализа использовали гены OXA23, ISAbaI, IMP, VIM, TEM, NDM. Последовательности специфических праймеров приведены в таблице.

Молекулярно-генетический анализ проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере С 1000TM (ThermalCycler, Bio-Rad, USA). ДНК выделяли с помощью набора для выделения геномной ДНК из бактериальных клеток (diaGene, «Диаэм», Россия).

Рабочая смесь содержала: 1 ед. HS Taq ДНК-полимеразы («Евроген», Россия), 1×буфер (10×: 600 mМ Tris-HCl, 250 mМ KCl, 15mМ MgCl2 , 100 mM 2-меркаптоэтанол, 1% Тритон-X-100, pH 8,5), 0,8 мМ смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (0,2 мМ каждого), 0,25 μМ каждого праймера и 50 нг ДНК. ПЦР проводили в условиях, рекомендованных авторами (табл.). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1–1,5% агарозном геле (Agarose Biotechnology Grade, «Amresco», USA) с окраской ДНК этидиум бромидом. Размер амплифицированных фрагментов определяли по стандартным маркерам молекулярной массы фрагментов ДНК, кратных 100 либо 50 парам нуклеотидов (п.н.) («СибЭнзим», «Евроген», Россия).

Первоначально все исследуемые штаммы разделили на три группы в зависимости от года выделения: в 2012 г., до коронавирусной инфекции (2019) и в период после этой инфекции (2023 г.). Частота встречаемости генов МБЛ IMP, VIM, TEM была следующей: в выборке 1 ген blaIMP определялся в 19%, в выборке 2 – в 28%, в выборке 3 – в 48% случаев.

Ген blaVIM – в 45, 50 и 70, blaTEM – в 4, 24 и 96% соответственно. У штаммов из выборки 1 ген МБЛ NDM-1 не встречался, в выборке 2 – уже в 32%, в выборке 3 – в 33% случаев.

Частота встречаемости гена оксациллиназы OXA-23 в выборках 1, 2, 3 была 32, 36, 37% соответственно.

Ген ISAba1 встречался в 60, 69 и 100% случаев в исследуемых группах штаммов (рис.).

Наиболее высокий рост частоты встречаемости генов выявлен для ISAbaI, IMP, VIM и TEM, превышающий таковой между анализируемыми выборками в несколько раз по сравнению с предыдущим семилетним временным разрывом (2012 и 2019 гг.).

В настоящее время резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам рассматривается как изменение генома бактерий в результате мутации и последующей селекции наиболее удачных вариантов.

Существует по крайней мере девять разных видов приобретенных МБЛ. Среди них IMP, VIM, TEM и NDM считаются наиболее важными с точки зрения распространенности и клинической значимости. Выявление генетических детерминант β-лактамаз – один из самых актуальных методов определения комплексной устойчивости к антибиотикам. Согласно мировым исследованиям, их распространенность составляет 10–95% [7-9]. МБЛ TEM – наиболее часто встречающаяся бета-лактамаза у грамотрицательных бактерий, обеспечивает устойчивость в том числе к сульбактаму, потенциальная терапевтическая эффективность которого выше, чем у других ингибиторов β-лактамаз (клавулановой кислоты и тазобактама) [7]. В соответствии с полученными данными наблюдается распространение этих МБЛ в популяциях P. aeruginosa с течением времени, особенно TEM (на 20% за период 2012–2019 гг., и еще на 72% – по сравнению с доковидным 2019 г.). Частота встречаемости IMP и VIM также возросла на 29 и 25% соответственно в целом и на 20% к послековидному 2023 г.

NDM-1 – еще одна МБЛ, эпидемиологически значимый маркер резистентных штаммов. Бактерии, несущие этот ген, резистентны к β-лактамным антибиотикам, включая пиперациллин/тазобактам, азтреонам, все карбапенемы, цефтазидим и цефепим, и сохраняют чувствительность только к тигециклину и колистину [8]. В популяции штаммов, выделенных в 2012 году, данный ген не встречался. В 2019 году его обнаружили уже у 32% штаммов. Интересно, что в постковидном периоде частота его встречаемости практически не изменилась.

Среди генетических детерминант антибиотикорезистентности описано несколько классов оксациллиназ, наибольшую роль среди них играет OXA-23, чаще всего у мультирезистентных штаммов и связана с развитием резистентности к карбапенемам [6]. Инсерционный элемент ISAba1 содержит промоторы, которые участвуют в экспрессии генов, кодирующих OXA-23. ISAba1 можно считать микробиологически значимым маркером резистентных госпитальных штаммов [6v7]. В последний исследуемый период (2019–2023 гг.) он встречался у 100% исследуемых штаммов, тогда как в 2019 году – у 69%. Но выявляемость OXA-23 повысилась лишь на 1%, при этом резких изменений за весь исследуемый период (2012–2023 гг.) не наблюдалось.

Следует отметить увеличение распространенности всех исследуемых генов. Особенно в постковидный период по сравнению с предыдущими возросла частота ISAba1 (с 60 до 100%), VIM (с 45 до 70%) и TEM (с 4 до 96%). Это отражает общие тенденции в популяциях микроорганизмов – возбудителей ИСМП, в том числе P. aeruginosa [1][10][11], и говорит о все более широком распространении детерминант антибиотикорезистент­ности и, соответственно, о повышении общего уровня устойчивости к антимикробным препаратам у возбудителей ИСМП.

Бактерии P. aeruginosa содержат генетические детерминанты антибиотикорезистентности, которые обрели широкое распространение в период пандемии COVID-19. Рутинные микробиологические методы не позволяют полноценно оценить спектр возбудителей у одного пациента, степень родства госпитальных штаммов, уровень антибиотикорезистентности и другие важные показатели. Для эффективной борьбы с ИСМП необходимо широкое использование современных генетических методов для мониторинга возбудителей ИСМП и антибиотикорезистентности, это позволит отразить реальную эпидемиологическую ситуацию и обеспечить эффективность профилактических мер.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – СЮЕ, ЗЕА

Сбор и обработка материала – СЮЕ, САА

Написание текста – СЮЕ, ЗЕА

Редактирование – ЗЕА