В эксперименте использованы 22 штамма Entero­coccus faecalis, выделенных из секрета предстательной железы у 43 мужчин репродуктивного возраста (20–45 лет) с ХБП. Микроорганизмы были выделены с помощью стандартных бактериологических методов и идентифицированы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия).

Фотометрическим методом определены антилизоцимная активность микроорганизмов (АЛА) [5], способность образовывать биопленки (БПО) [6], адгезия (ПА) [7], гемолиз (ГА – гемолитическая активность) [8], иммуноферментным методом – sIgA – протеазная активность [9] и способность энтерококков вызывать изменение концентраций IL17A, TNFα, IL8 [10].

Резистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом в соответствии с методическими указаниями 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [11]. В работе использовали официнальные диски с амикацином, канамицином, неомицином, гентамицином, ванкомицином и тетрациклином (ЗАО «НИЦФ», Санкт-Петербург).

ДНК выделяли из суточной агаровой культуры энтерококков с помощью набора «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Амплификацию ДНК осуществляли на амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия).

Присутствие генов патогенности и резистентности определяли с помощью специфической и мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, синтезированных фирмой «Синтол» (Москва, Россия) [12][13].

Статистический анализ результатов проводился с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007.

Установлено, что из секрета предстательной железы 51 ± 7,62% мужчин с ХБП были выделены энтерококки, среди всех выделенных микроорганизмов, штаммы E. faecalis изолировали в 18,0 ± 8,1% случаев. При этом в монокультуре они обнаруживались в 72,7 ± 7,8% случаев, в ассоциациях с коагулазоотрицательными стафилококками (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus) – в 27,3 ± 7,8% случаев. Обсемененность секрета простаты энтерококками составляла в среднем 3×10³ КОЕ/мл.

У выделенных штаммов E. faecalis определен комплекс биологических свойств (вирулентные и персистентные характеристики) (рис. 1). Показано наличие у штаммов E. faecalis ГА у 68,1 ± 12,3% штаммов со средним значением 8,6 ± 0,8%; адгезивной способностью характеризовалось 59,1 ± 13,6% культур энтерококков со средним показателем 36,9 ± 1,3%.

Установлено, что АЛА и БПО обладали все штаммы, при этом коэффициент БПО был равен 2,0 ± 0,1 у. е., а уровень АЛА составил 1,32 ± 0,04 мкг/мл*ОП. Анализ частоты встречаемости sIgA-протеазной активности у изученных штаммов энтерококков показал наличие данного признака у всех культур со средним значением 22,1 ± 0,4%.

Проявление АЦА у энтерококков различалось в зависимости от вида цитокинов. Так, IL17A инактивировало 31,8 ± 17,6% штаммов, IL8 – 68,2 ± 12,0% культур, а TNF-α – все изоляты энтерококков, с уровнем выраженности признака 4,7 ± 0,1; 5,6 ± 0,2; 2,5 ± 0,3 пг/мл соответственно.

Установлено, что все штаммы E. faecalis имели в составе генома какие-то гены вирулентности, в том числе в различных комбинациях (рис. 2). Гены протеолитических ферментов gelE и sprE были выявлены у 63,6 ± 10,3 и 54,5 ± 10,6% штаммов соответственно. Гены, ответственные за продукцию цитолизинов cylLl и cylM, зарегистрированы у 54,5 ± 10,6% культур, cylА, cylB и cylLs – у 45,5 ± 10,6% штаммов. Ген esp содержали 45,5 ± 10,6% изолятов, а ген asa – 81,8 ± 8,2% клинических штаммов. Детерминанты, кодирующие синтез энтероцинов и ответственные за продукцию гиалуронидазы, у изученных штаммов E. faecalis не были выявлены.

У 9,1 ± 6,1% штаммов энтерококков изолированно встречался один ген gelE, у остальных урогенитальных изолятов E. faecalis зафиксировано наличие сочетаний генов: два гена (gelE и sprE) присутствовало у 9,1 ± 6,1% культур, три гена (gelE, sprE и asa) обнаружено у 45,5 ± 10,6% изолятов, а комбинация из 7 генов (полный комплекс генов сyl-оперона) определилась у 36,6 ± 10,3% изолятов.

Все культуры E. faecalis были резистентны к амикацину, в 90,1 ± 6,4% случаев – к канамицину, в 63,3 ± 10,3% – к неомицину, к гентамицину и тетрациклину – в 36,4 ± 10,3%, к ванкомицину – в 72,7 ± 9,5% (рис. 3).

У выделенных изолятов E. faecalis была изучена распространенность детерминант резистентности к указанным антибиотикам (рис. 4). Определено наличие гена aac(6')-Ie-aph(2»)-Ia у 18,2 ± 8,2% культур, а гена aph(3')-IIIa – в геноме всех клинических изолятов, тогда как ген ant(4')-Ia с аналогичной функцией не был обнаружен ни у одного из штаммов.

Ген tetM (резистентность к тетрациклину и миноциклину) выявлялся у всех штаммов E. faecalis, а ген tetL – только у 36,4 ± 10,3% культур.

Анализ наличия генов резистентности к гликопептидам выявил, что все культуры обладали геном vanA; в 54,5 ± 10,6% случаев содержали ген vanB, а гены vanC-1 и vanC-2/3 определялись у 63,6 ± 10,3 и 36,4 ± 10,3% клинических изолятов E. faecalis соответственно.

Факторы вирулентности и персистенции бактерий участвуют в инициации воспалительного процесса в инфицированных биотопах макроорганизма, способствуют увеличению продолжительности инфекционно-воспалительных заболеваний и их хронизации [14][15]. Обнаруженная у всех изученных клинических изолятов фекального энтерококка способность к инактивации лизоцима макроорганизма и биопленкообразованию определяется как патогенетически значимый фактор развития ХБП. Не исключено, что этому способствует наличие у урогенитальных штаммов энтерококков способности инактивировать TNF-α, который усиливает воспалительный процесс и способствует санации тканей от патогенов. Мы также обнаружили способность энтерококков ингибировать sIgA, играющий важную роль в иммунной защите слизистых оболочек от бактериальной агрессии.

Анализ генотипов E. faecalis показал наличие у них генов gelE, sprE, esp, asa, комплекса генов cyl-оперона. Ранее показано, что подобные генетические детерминанты обнаруживаются преимущественно у клинических изолятов E. faecalis, тогда как у энтерококков – представителей нормальной микробиоты – указанные гены выявляются крайне редко [13].

Анализируя результаты антибиотикограмм изу­ченных урогенитальных штаммов E. faecalis и данные о присутствии у них генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, не удалось обнаружить «оптимального» антибактериального препарата, который бы обладал высокой активностью в отношении энтерококков как потенциальных возбудителей ХБП. Можно полагать, что множественная лекарственная устойчивость энтерококков связана с неоднократно проводимыми курсами антибактериальной терапии больных с ХБП. Изученные нами изоляты энтерококков в 72,7 ± 9,5% случаев проявляли фенотипическую устойчивость к ванкомицину и часто имели в своем геноме те или иные комбинации двух и более детерминант резистентности к гликопептидам (vanA, vanB, vanC-1 и vanC-2/3).

Полученные данные указывают на необходимость проведения локального (внутрибольничного) мониторинга динамики распространения и циркуляции антибиотикорезистентных штаммов E. faecalis. Таким образом, возникает целесообразность перехода от эмпирического к персонифицированному выбору препаратов для антибактериальной терапии пациентов с ХБП.

Урогенитальные изоляты E. faecalis имеют генетические детерминанты, кодирующие факторы вирулентности и персистенции, и определяют выраженный патогенный потенциал фекальных энтерококков. Эти микроорганизмы могут не только инициировать воспалительный процесс в предстательной железе, но и способствуют хроническому течению бактериального простатита. Выраженная устойчивость бактерий ко многим широко используемым в клинической практике антимикробным препаратам делает труднодостижимым положительный клинический эффект от проводимой антибактериальной терапии пациентов с ХБП энтерококковой этиологии.

Полученные результаты о патогенных биопрофилях урогенитальных изолятов E. faecalis полезны для оптимизации диагностики и прогнозирования ХБП. Показатели устойчивости к антибактериальным препаратам (на уровне фено- и генотипа) энтерококков позволят повысить эффективность терапии пациентов с данной патологией.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: исследования были проведены в рамках госзадания FUUG – 2022-0007 «Исследование симбиотических систем про- и эукариот в биологии и медицине».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – КОЛ, ПОА, ПТМ, ВАГ

Сбор и обработка материала – ПОА, ПТМ, ПЛП

Статистическая обработка – ПОА, ПЛП

Написание текста – КОЛ, ПОА, ПТМ

Редактирование – КОЛ, ПОА, ПТМ, ВАГ