Эксперимент проводили на половозрелых крысах-самцах Wistar (200–250 г) в соответствии с положениями Хельсинкской декларации и рекомендациями Директивы Европейского сообщества (86/609 Г.С), дизайн исследования одобрен междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (№ 9 от 16.05.2022 г.). Потенциально болезненные вмешательства и эвтаназия животных осуществлялись при использовании комбинированного инъекционного наркоза: золетил 0,003 мг/г (Virbac, Франция), ксиланит 0,008 мг/г (ЗАО «НИТА-ФАРМ», Россия, г. Саратов). Для воспроизведения инерционной ЧМТ применяли установку с падением груза массой 200 г с высоты 1 м на теменную область головы животного [13]. Эндотоксинемию имитировали путем многократного внутримышечного многократного введения раствора пирогенала в дозе 33,3 мг/кг (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России). Исследование включало следующие группы: 1‑я – интактные крысы, контроль (n = 12); 2‑я – животные после нанесения ЧМТ (n = 12); 3‑я – троекратное введение (1, 3, 4‑е сутки) пирогенала без ЧМТ (n = 12); 4‑я – троекратное введение пирогенала (1, 3, 4‑е сутки) сразу после нанесения ЧМТ (n = 12). На 6‑й день от начала эксперимента при общей анестезии у крыс извлекали легкие с фиксацией в этаноле 96° или в нейтральном формалине (Биовитрум-ООО) в течение 24 ч, обезвоживали, проводили дегидратацию в хлороформе и заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Для иммуногистохимического выявления рецептора CD14, эндотелина-1 и проколлагена 1‑го типа (P1NP) использовали первичные антитела к антигенам крыс и мышей (Elabscience КНР), комплексы антиген – антитело выявляли DAB методом с помощью вторичных антител (Elabscience КНР). Срезы дополнительно подкрашивали гематоксилином Майера (Биовитрум-ООО). Гистохимическое выявление катионов кальция проводилось путем окрашивания насыщенным спиртовым раствором ализарина красного С и борной кислотой или по методу Косса (Биовитрум-ООО) [13]. Аргирофильные волокна в тканях легкого, выявленные по методу Фута изучали с помощью набора для импрегнации серебром (Биовитрум-ООО). Толщину межальвеолярных перегородок и периваскулярных муфт артерий оценивали с помощью программных пакетов для морфометрического анализа клеток CellSens и NISElements (Olympus, Nikon, Япония).

Для статистического анализа использовали программное обеспечение Statistica 12 (Stat Soft, Inc., США) и Microsoft Excel (Microsoft Office 2016). Нормальность распределения полученных результатов проверяли с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Данные представлены как значение среднего и его стандартного отклонения (m ± s). Для оценки достоверности различий при сравнении двух групп переменных использовали t-критерий Стьюдента. Показатели считались достоверными при уровне значимости p < 0,05.

В легких травмированных животных при эндотоксинемии по сравнению с органометрическими характеристиками этого органа крыс других групп установлено достоверное изменение морфометрических показателей кровеносных сосудов и альвеол, что указывает на преобразование функций интерстиция легкого. Так, значимо увеличивалась толщина межальвеолярных перегородок и адвентициальных муфт дистальных ветвлений легочных артерий, что указывало на отек межуточной ткани (табл. 1). Снижалось число и эластичность бронхиальных артерий, на что указывало увеличение толщины внутренней и наружной эластических мембран, при импрегнации серебром по Футу обнаруживалось повышение плотности аргирофильных волокон соединительной ткани (рис. 1 а, б, в). Достоверное снижение интенсивности и спектральных характеристик флуоресценции эластических мембран артерий также было отмечено в легких этих животных (рис. 1 г, д, е). При сочетании ЧМТ и эндотоксинемии в адвентициальной оболочке вокруг сосудов формировались обширные периваскулярные пространства, где визуализировались CD14 и эндотелин‑1 позитивные лейкоциты и тучные клетки в различной степени дегрануляции, что указывало на существенное значение этой структуры в качестве места локализации периваскулярного инфильтрата (табл. 2, рис. 2). Уменьшалась толщина адвентициальной оболочки каудальных вен в области контакта с паренхимой легких, опосредованного соединительной тканью с существенным изменением мышечной и соединительной тканей среднего и внешнего слоев их стенки.

Таблица 3

У травмированных крыс при эндотоксинемии в легком достоверно изменялись морфометрические показатели дистальных воздухоносных путей четвертого порядка по сравнению с таковыми для интактных крыс (табл. 3). Обнаружено уменьшение диаметра просвета бронхов третьего и четвертого порядка и выявлены особенности строения расположения в слизистой оболочке эластических и ретикулярных волокон соединительной ткани, что указывало на изменение механизма регуляции тонуса бронхов, причем в бронхиальном секрете отмечались CD14 и эндотелин‑1 позитивные клетки (табл. 2).

При спектральной оценке флуоресценции установлено достоверное снижение свечения волокон соединительной ткани стенки дистальных бронхов четвертого порядка (табл. 2). В бронхиальном эпителии обнаруживалась аргирофилия ядрышек эпителиоцитов и сдвиг ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону ядра, что свидетельствовало о снижении степени дифференцировки клеток и наличии их пролиферативной активности. В просвете бронхов второго, третьего и четвертого порядка увеличивалось содержание бронхиального секрета и лейкоцитов с аргентофинными ядрами и ядрышками, а также эндотелин-1 и CD14 позитивных клеток. Обнаружена частичная обтурация (25–50%) бокаловидных и эндотелин-1 и CD14 позитивных клеток в просвет дистальных бронхов.

Повреждение мозга при ЧМТ приводит к морфофункциональному поражению легких через нейрогенные механизмы, а развившаяся дыхательная недостаточность и гипоксия, в свою очередь, усугубляют деформацию головного мозга. Эндотоксинемия является критически важным «вторым ударом» после первоначального нейрогенного повреждения [6][9]. Использованная нами модель сочетания ЧМТ эндотоксинемией позволила обнаружить маркеры, характеризующие наличие системного воспаления при остром течении процесса. К ним относятся: уменьшение диаметра просвета внутрилегочных артерий дистальных отделов и дыхательных путей, скопление и миграция CD14 позитивных макрофагов в просвет бронхов, стенку ацинуса легкого и периваскулярном пространстве, изменение размеров и формы клеток бронхиального эпителия, увеличение количества и соотношения морфотипов тучных клеток в бронхиальных артериях, паренхиме, висцеральной плевре, адвентициальной и средней оболочках каудальной легочной вены. Эндотоксинемия на фоне ЧМТ в острый период переводит локальное нейрогенное воспаление в легких в разряд системного. Структурные изменения артерий, которые сопровождались уменьшением диаметра, увеличением толщины внутренней и наружной эластических мембран при высокой аргирофилии последних, свидетельствовали о наличии защитных противоотечных реакций кровеносных сосудов, которые синергичны рефлексу Китаева [14].

Перечисленные маркеры однозначно указывают на развитие острого диффузного альвеолярного повреждения и тяжелого воспалительного процесса в легких, что является ключевым звеном в патогенезе ОРДС. Понимание роли эндотоксинемии кардинально меняет подход к ведению пациентов с ЧМТ, для которых необходимы совершенно новые подходы к терапии. Например, в качестве мер профилактики необходимо раннее начало нутритивной поддержки в виде энтерального питания для поддержки целостности кишечного барьера и предотвращения атрофии слизистой оболочки [14]. Так, для лечения пациентов применяют невсасывающиеся антибиотики и антисептики для подавления грамотрицательной флоры в кишечнике, что снижает уровень эндотоксинемии, то есть методы селективной деконтаминации желудочно-кишечного тракта с коррекцией дисбиоза [8][9]. Смешанное, нейрогенное и септическое повреждение легких требует более тщательного контроля за инфекциями и, возможно, иного подхода к иммуномодуляции и мониторинга функций кишечника.

В острый период развития ЧМТ эндотоксинемия индуцирует механизмы системного воспаления в ткани легких и является значимым патогенетическим фактором посттравматического синдрома.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ЗСВ, ВБШ, НГП

Сбор и обработка материала, в том числе статистическая, – ЗСВ

Написание текста – НГП