Материалами исследования являются 9 новых селективных ингибиторов карбоангидразы II типа (ИКАII) – производные сульфонамидов с лабораторными шифрами В1–3, В10–13, В18, В24. Сотрудниками отдела химической разработки ЦТФТ им. М.В. Дорогова нам были предоставлены данные об селективности исследуемых веществ относительно некоторых изоформ карбоангидразы (табл. 1).

Всего в экспериментах были использованы 181 мышь линии ICR (CD-1) массой 30–40 г и 119 крыс линии Wistar массой 210–350 г. (питомник ООО «СТЕЗАР»). Животные были распределены на две группы: контроль и опыт, по 6 особей для крыс и по 10 особей для мышей. В качестве контроля во всех видах опытов использовался натрия хлорид – СОЛОфарм 0,9%. Животные содержались при температуре 22 ±2 °C, влажности 55 ± 5% и 12/12-часовом световом цикле, со свободным доступом к пище и воде. Исследование на животных одобрено независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол № 69 от 13.09.2024 г. Поведенческие реакции (анксиолитическую, антидепресивную, локомоторную, когнитивную активность и эмоциональную реактивность) исследовали на моделях при помощи методик «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Подвешивание за хвост». Установки для изучения поведенческих реакций были приобретены у ООО «НПК Открытая Наука». Соединения вводили внутрибрюшинно за 30 минут до эксперимента в дозе 10 мг/кг.

Методика «Открытое поле» позволяет выявить действие препарата на ориентировочную, двигательную, исследовательскую активность; используется и для выявления анксиолитического действия препаратов (проявляется в устранении страхов у грызунов, что увеличивает их двигательную активность). Наблюдение за животными проводилось 5 минут. Регистрировали следующие параметры: горизонтальную активность (количество секторов, пересеченных животным), вертикальную активность (количество подъемов на задние лапы с опорой на стенку или без нее), исследовательскую активность (количество заглядываний в «норки»), эмоционально-поведенческую активность – груминг (количество облизывания лап и чистка передней части морды и тела) и эмоциональную реактивность (количество экскрементов).

Методика «Приподнятый крестообразный лабиринт» основана на естественном избегании открытых и светлых участков, а также боязни падений с высоты у грызунов. Данный метод позволяет выявить анксиолитическое действие препарата, которое проявляется в виде увеличения числа заходов, свешиваний и времени нахождения в открытых рукавах лабиринта. Количество заходов в рукава используется как показатель общей моторной активности. В течение 5 минут регистрировались следующие параметры: время пребывания в рукавах, количество стоек в открытых и закрытых рукавах и количество свешиваний в открытых рукавах [10].

Методику «Подвешивание за хвост» используют для выявления действия антидепрессантов. В этом тесте фиксируют время иммобилизации и активности у мышей, которые подвергаются кратковременному неизбегательному стрессу. Общее время тестирования составляет 6 минут для каждой мыши. За период тестирования отмечают начало иммобилизации, ее продолжительность и время активности животного, которое делает попытки побега. Маятникообразные движения висящей мыши не засчитываются как время активности [11].

Полученные результаты подвергались статистической обработке при помощи программы БИОСТАТИСТИКА. Количество определений каждого показателя в различных опытах составляло 6–10. Для межгрупповых сравнений использовался критерий t Стьюдента (при наличии нормального распределения) и непараметрический критерий Уилкоксона (при его отсутствии), для множественных сравнений использовался критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Достоверность внутригрупповых различий определялась по парному критерию t Стьюдента. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Исследования «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» проходили на двух видах животных: мыши и крысы. Сопоставление результатов, полученных у мышей и крыс, позволяет более объективно оценить фармакологическую активность изучаемых препаратов.

Анализ полученных данных у мышей (табл. 2) показал, что препараты В1, В2 и В3 достоверно снижали локомоторную активность животных. Вещество В1 снижало локомоторную активность на 55,6%, В2 – на 66,1% и В3 – на 44,8%. Вертикальная активность снижалась более существенно: В1 – на 94,8%, В2 – на 99,2% и В3 – на 76,2%. Также при введении В2 снижалась исследовательская активность почти в 2 раза, а использование В3 повышало эмоциональную реактивность в 3,4 раза. Также следует отметить достоверное повышение исследовательской активности на 63,3 и 55,0% при введении В 18 и В10 соответственно. Также при использовании В24 имело место повышение эмоциональной реактивности. Тенденцией к увеличению горизонтальной активности обладали В12 и В13, а при введении В18 наблюдалась тенденция к увеличению и вертикальной и горизонтальной активности. В11 и В24 имели тенденцию к увеличению исследовательской активности.

У крыс при использовании теста «Открытое поле» (табл. 3) имело место достоверное повышение локомоторной активности на фоне введения В12 и В24 (увеличение горизонтальной активности в 2 и 1,8 раза), причем В24 способствовал повышению и горизонтальной активности в 2,5 раза. Короткий груминг (антистрессорное поведение) при использовании В3 и В24 возрастал в 1,9 и в 2,5 раза; исследовательскую активность (когнитивные функции) повышали В1 (+79,1%) и В24 (+109,3%).

Следующей методикой определения анксиолитической активности исследуемых препаратов у животных был «Крестообразный лабиринт», наиболее важными параметрами которой являются время пребывания в открытых рукавах лабиринта и количество стоек там же, а также количество свешиваний.

Анализ таблицы 4 показал, что введение В24 мышам достоверно в 3 раза повышало продолжительность пребывания мышей в открытых рукавах и в 9,5 раз достоверно увеличивало количество свешиваний по отношению к контролю; количество стоек в открытых рукавах лабиринта также увеличивалось в 7,5 раза, но имело характер тенденции. Время пребывания в открытых рукавах достоверно в 1,4 раза повышало соединение В10. В остальных случаях наблюдалась лишь тенденция к положительным результатам: В2 – продолжительность пребывания в открытых рукавах и количеством свешиваний; В3 и В10 – количество свешиваний.

Анализ данных таблицы 5 показал, что у крыс значимой анксиолитической активности обладает В24, которое в 3,5 раза повышает продолжительность нахождения в открытых рукавах и в 6,5 раза – количество свешиваний; имеет место тенденция (2,4 раза) к повышению стоек в открытых рукавах. Значимой анксиолитической активностью обладает также В1, который почти в 4 раза повышает время нахождения в открытых рукавах и в 7,5 – количество свешиваний. При введении В2 и В10 имеет место тенденция к продолжительности нахождения в открытых рукавах и количестве свешиваний.

Тест «Подвешивание за хвост» позволяет предположить у изучаемых веществ антидепрессивное действие. Из таблицы 6 видно, что латентный период иммобилизации достоверно повышает в 2,1 раза соединение В13. У соединений В12, В11 и В24 имеет место лишь тенденция на 60–80% к увеличению данного показателя. Общее время иммобилизации достоверно снижает только В24 (на 56,4%), а соединение В18, наоборот, удлиняет продолжительность иммобилизации на 82,8%. Аналогично предыдущему показателю, только В24 повышает общее время активности на 20,5%. В то же время В18 его снижает на 30,3%.

Как известно, карбоангидраза прежде всего катализирует синтез и распад угольной кислоты, являясь важным фактором регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме. Всего у человека описано 15 изоформ фермента, из которых карбоангидраза II типа (КА II) наиболее широко распространена в головном мозге. У человека она экспрессируется в олигодендроцитах, миелинизированных трактах, астроцитах и миелиновых оболочках мозга [12]. Имеются литературные данные, что в экспериментах на животных ингибиторы КА II обладают клинически значимым анксиолитическим эффектом, способствуя нормализации у них поведенческих реакций при тяжелом эмоциональном стрессе. Таким образом, эти данные указывают, что селективные ингибиторы КА II могут быть перспективными соединениями для разработки нового класса транквилизаторов, имеющих иной механизм действия и более благоприятный профиль безопасности, чем бензодиазепиновые транквилизаторы.

Поскольку у крыс и мышей существует межвидовая разница в однотипных поведенческих реакциях, то для более объективной оценки полученных данных эксперименты проводились на обоих видах лабораторных животных.

Методика «Открытое поле» – одна из наиболее распространенных при изучении поведения у животных. В наших экспериментах, прежде всего, она показала, что имели место существенные различия в полученных результатах у мышей и крыс. Так, у  крыс, в отличие от мышей, не наблюдалось угнетающего действия (выраженное снижение локомоторной активности и исследовательского поведения) при введении веществ В1, В2 и В3. Более того, у веществ В12 и В24 (в отличие от мышей) достоверно повышалась локомоторная активность. Снижение локомоторной активности можно трактовать как повышение уровня тревожности у животных [13]. В то же время ее активация является проявлением адаптивного поведения животных в условиях незнакомой обстановки (аналог анксиолитического действия). Повышение короткого груминга крыс на фоне применения В3 и у В24 является выражением антистрессового поведения. И если у мышей повышение исследовательской активности при введении В24 имело вид тенденции, то у крыс были получены достоверные результаты.

На основании полученных результатов на обеих видах животных можно сделать заключение, что в методике «Открытое поле» В24 обладает наибольшей анксиолитической активностью среди изученных препаратов и одновременно способно повышать когнитивные функции. За ним следует соединение В12 (достоверное повышение локомоторной активности и тенденция к повешения исследовательской активности у крыс) и В18 (тенденция локомоторной активности и достоверное повышение исследовательской активности у мышей). Соединения В1, В2 и В3 на мышах обладали анксиогенной активностью, причем на фоне введения В2 достоверно снижалась исследовательская активность и имела место тенденция к снижению короткого груминга.

Крестообразный лабиринт является основной методикой выявления анксиолитического действия. Сопоставляя данные, полученные у мышей и крыс, можно отметить, что выраженной анксиолитической активностью и в том, и в другом случае обладает только В24 [14]. Далее по убывающей активности следует В10, который достоверно увеличивает время пребывания в открытых рукавах у мышей и в виде тенденции – у крыс. Также данное соединение и у крыс, и у мышей в виде тенденции повышает количество свешиваний. В1 только у крыс достоверно повышает время пребывания в открытой части лабиринта и количество свешиваний. В2 в виде тенденции и у крыс, и у мышей повышает время пребывания в открытых рукавах и количество свешиваний.

Исследование антидепрессивной активности у селективных ингибиторов КА показало, что ее наличие можно предположить только у соединения В24 и нельзя исключить его наличия у соединения В13. В то же время соединение В18 усугубляет депрессивное состояние у животных.

Обобщая полученные данные, то можно составить следующий ряд анксиолитической активности у исследуемых веществ: В24 (+антидепрессивный эффект) >> В10 ≥ В12 > В18 (вероятность усиления депрессии).

В данных экспериментах выявлено, что соединение В24 и на крысах, и на мышах обладает анксиолитической и антидепрессивной активностью, а также повышает когнитивные функции животных. Также потенциально анксиолитическим действием обладает соединение В10, В12 и В18, а антидепрессивной активностью – В13.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: научное исследование выполнено за счет гранта в форме субсидий (соглашение № 25НП/2024).

Участие авторов:

Проведение эксперимента, первичный анализ полученных данных – ЛОЭ

Разработка концепции и дизайна исследования – ФВН

Анализ литературы и оформление списка литературы, написание введения – ШАА

Синтез исследуемых соединений – САВ

Работа с рукописью и проверка критически важного интеллектуального содержания – ССШ