Локализация NO-синтазы и малых апоптотических молекул в слизистой оболочке полости носа при полипозном риносинусите

Полипозный риносинусит (ПРС) характеризуется хроническим воспалением, активной пролиферацией эпителия и соединительнотканных клеток слизистой оболочки полости носа [1]. Большое значение в активации полипозного роста представляют воспалительные и аллергические факторы, нейропептиды и газообразные мессенджеры [1][2]. Их гетерогенное и комплексное воздействие на слизистую оболочку ведет к формированию трех клинико-морфологических типов полипов: отечному с гиперплазией слизистых желез, аллергическому (эозинофильному) и фиброзному с выраженным кистообразованием и васкуляризацией серозно-слизистых желез в подслизистой основе [1][3]. ПРС является мультифакторным заболеванием, часто встречается в сочетании с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов, бронхиальной астмой, муковисцидозом и синдромом Картагенера [1][2][4].

Известно, что ведущая регулирующая роль в патогенезе ПРС принадлежит избыточной продукции оксида азота (NO), который участвует в регуляции мукоцилиарной активности, сосудистого тонуса, оказывает выраженное провоспалительное действие [5]. Продукты метаболизма NO также модулируют клеточный цикл, нарушение которого неизменно связывают с формированием полипов [5][6]. Однако изменения молекулярного сигналинга и динамики обновления клеток при полипозной трансформации остаются невыясненными.

Цель настоящей работы состояла в изучении локализации NO-синтазы и маркеров апоптоза в слизистой оболочке полости носа у пациентов с ПРС.

Материал и методы

Исследовали биопсийный материал полипов полости носа и участков слизистой оболочки нижних носовых раковин пациентов женского и мужского пола в возрасте 35–70 лет (n = 70, средний возраст 57,4 ± 1,52 года), находящихся на хирургическом лечении в оториноларингологическом отделении КГБУЗ «Владивостокская клиническая больница № 1». Исследование одобрено междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава РФ (протокол № 5 от 17 января 2022 г.) и соответствует Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинский исследований с участием человека». Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании.

Основную группу составлял материал полипов, полученный от пациентов (n = 50) во время хирургической операции (полипотомия) с клиническим верифицированным диагнозом «полипозный риносинусит» без сопутствующей воспалительной (гнойный верхнечелюстной риносинусит) и аллергической (аллергический ринит, бронхиальная астма, аспириновая триада) патологии слизистой оболочки носа.

В качестве контроля исследовались два варианта образцов слизистой оболочки полости носа. Первая группа (контроль I) – материал слизистой оболочки полости носа, полученный у пациентов с диагнозом «искривление перегородки носа», которым была проведена риносептопластика (n = 20) без полипозной и сопутствующей воспалительной и аллергической патологии. Вторая группа (контроль II) – материал слизистой оболочки нижних носовых раковин (n = 50), полученный у пациентов с клиническим диагнозом «полипозный риносинусит», составляющих основную группу.

Критерии исключения из исследования: тяжелое иммунодефицитное состояние (ВИЧ-инфекция, заболевания крови и пр.), антрохоанальные полипы, инвертированная папиллома, злокачественные заболевания полости носа и околоносовых пазух.

Материал фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере в течение 24 часов, после чего промывали 0,1-М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) с 6–7-кратной сменой раствора и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 5 мкм монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали и инкубировали с первичными мышиными моноклональными антителами против iNOS (Abсam, ab3523, Великобритания) в разведении 1:100, nNOS (Abсam, ab40662, США) в разведении 1:150, p53 (Abсam ab28, Великобритания) в разведении 1:250 и кроличьими моноклональными антителами против caspase-3 (Thermo Fisher Scientific 700182, США) в разведении 1:50. Антитела разводили на фосфатном буфере, содержащем Тритон Х-100 и бычий сывороточный альбумин, инкубировали в течение ночи при температуре 4 °С. После промывки срезы в течение 1 ч инкубировали в растворе биотинилированных вторичных антител против иммуноглобулина кролика и мыши соответственно первичным антителам, в разведении в соответствии с инструкциями фирмы производителя (Vector Laboratories, США). После отмывки вторичных антител препараты инкубировали в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, США). Срезы выдерживали в 0,03% растворе диаминобензидина и 0,01% перекиси водорода на фосфатном буфере в течение 10–20 мин, затем промывали, обезвоживали и заключали в бальзам по обычным правилам. В качестве контроля из среды исключали первичные антитела, окрашивание клеток отсутствовало. Часть срезов докрашивали гематоксилином Майера.

Препараты изучали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифровой камеры AxioCam ICc3. Морфометрическую обработку полученных фотографий проводили при помощи пакета программ AxioVision 4.8.1. На микрофотографиях оценивали плотность распределения иммунопозитивных клеток слизистой оболочки носа в контрольных группах и ткани полипа. Данные измерения проводились на срезах, докрашенных гематоксилином Майера в 10 неперекрывающихся полях зрения на каждом препарате. Определение площади иммуногистохимического окрашивания проводили с использованием программы ImageJ 4.0 и Scion ImageJ после получения изображения камерой AxioCamICc3 Rev.3 (Carl Zeiss). Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 10. Значение исследуемых объектов отличалось от нормального распределения (критерии Шапиро – Уилка). В сравниваемых группах количественные данные представляли в виде медианы и межквартильных интервалов Med (Н_кв, В_кв), где Med – медиана, Н_кв – нижний квартиль, В_кв – верхний квартиль. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t-критерия достоверности по Стьюденту (p < 0,05).

Результаты исследования

В слизистой оболочке полости носа контрольной группы I выявляется экспрессия nNOS, которая распределяется преимущественно в субэпителиальной и железистой зоне собственной пластинки слизистой оболочки. Фермент локализуется в нервных волокнах, оплетающих концевые отделы и выводные протоки желез (рис. 1 а). Эпителиоциты слизистой оболочки nNOS не содержат.

Характер локализации nNOS в слизистой оболочке контроля II меняется при ПРС и зависит от морфологического типа полипов. Количество nNOS-реактивных клеток здесь закономерно увеличивается во всех слоях слизистой оболочки, а плотность nNOS-позитивных нервных волокон неизменно снижается (табл.). В ткани полипов отечного типа nNOS локализуется главным образом в клетках концевых отделов желез и их выводных протоков (рис. 1 б). При полипах эозинофильного (аллергического) типа nNOS избирательно выявляется в эпителии, а в собственной пластинке маркирует эндотелиоциты микрососудов, выводные протоки и концевые отделы желез. При полипах фиброзного типа возрастание экспрессии nNOS определяется в отдельных железистых элементах, субэпителиальных участках соединительной ткани и микрососудах (рис. 1 в), иногда встречается на уровне базальной мембраны (табл.).

Для ткани полипов характерно преимущественное субэпителиальное распределение nNOSиммунореактивных структур, где выявляются нервные волокна и фибробластоподобные клетки. При отечном и эозинофильном (аллергическом) типах полипов nNOS-позитивные клетки и волокна обнаруживаются по ходу кровеносных сосудов. В полипах фиброзного типа nNOS маркирует эпителиоциты желез, небольшую популяцию мононуклеарных клеток и единичные нервные волокна (рис. 1 г).

В слизистой оболочке полости носа у пациентов из группы контроля I экспрессия iNOS резко снижена.

Здесь iNOS преимущественно локализуется в апикальной части эпителиоцитов выводных протоков желез (рис. 2 а). Активность iNOS в слизистой оболочке контроля II значительно нарастает в первую очередь за счет экспрессии фермента в стенке кровеносных сосудов и железистых эпителиоцитах.

В образцах ткани полипов отечного типа iNOS локализуется в реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитах и в клетках субэпителиального слоя. В железистой зоне собственной пластинки данный маркер присутствует в эндотелиоцитах микрососудов и умеренно маркирует соединительнотканные клетки (рис. 2 б). В полипе эозинофильного (аллергического) типа iNOS маркирует лишь небольшую группу эпителиоцитов железистой зоны, но активно маркирует обширную популяцию клеток воспалительных инфильтратов. В полипах фиброзного типа фермент выявляется в клетках субэпителиальной зоны, стенке крупных кровеносных сосудов и железистых эпителиоцитах.

Во всех слоях слизистой оболочки полости носа группы контроля I мы обнаружили небольшое количество р53и каспаза-3-реактивных клеток. В группе контроля II р53 и каспаза-3 выявлялись преимущественно в клетках воспалительных инфильтратов (табл.).

Маркеры апоптоза при ПРС выявляются во всех слоях слизистой оболочки и в очагах воспалительных инфильтратов. В полипах всех исследованных типов отмечается высокая экспрессия р53 и умеренная позитивная реакция на каспазу-3 (рис. 3 а, в). Иммунореактивные клетки, как правило, располагаются под базальной мембраной, вокруг сосудов или диффузно в рыхлой соединительной ткани. В собственной пластинке слизистой оболочки определяется заметное увеличение р53-иммунопозитивных клеток (табл.).

В ткани полипов фиброзного типа выявляются участки с редкими скоплениями каспаза-3-реактивных фибробластов. Кроме того, в глубоких слоях собственной пластинки и под эпителием располагаются очаговые или диффузные полиморфноклеточные инфильтраты с умеренной иммунореактивностью на каспазу-3 (рис. 3 г). Распределение р53 преобладает в клетках субэпителиального слоя (рис. 3 б). (табл.)

Обсуждение полученных данных

В настоящей работе показано возрастание экспрессии nNOS/iNOS в клетках слизистой оболочки полости носа при ПРС, которое коррелирует с распределением проапоптотических факторов и зависит от клиникоморфологического типа полипов.

Значение апоптоза в развитии хронических воспалительных заболеваний подтверждено в ряде исследований [7–9]. Хорошо известны морфологические критерии апоптоза и сложные каскады молекулярных реакций, запускающих и стабилизирующих программированную гибель клеток [10–12]. Апоптоз инициируют более 30 факторов, однако его эффекторную стадию запускают каспаза-3 и факторы транскрипции р53 и р21. Баланс этих молекул контролируют пептиды, блокирующие наступление апоптоза, где Bcl-2 и MDM2 принадлежит основная регулирующая роль [13][14].

Развитие ПРС происходит на фоне повышенной выработки ключевых воспалительных факторов (IL-5, CCL11, TNF, TGF-β) и нейропептидов (субстанция P, вазоинтестинальный полипептид, нейропептид Y). Эти факторы способны индуцировать также патологические формы апоптоза клеток слизистой оболочки полости носа [14][15]. Однако по другим данным [9], в ткани полипов обнаруживается сверхэкспрессия противоапоптотического белка Bcl-2, который противостоит распространению апоптоза. По нашим данным, ПРС сопровождается увеличением количества р53-иммунореактивных клеток и умеренной экспрессией каспазы-3 в эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки.

Наибольшее количество р53-иммунореактивных клеток выявляется в полипах аллергического типа. В этом случае превалируют иммунокомпетентные клетки, эозинофилы и тучные клетки. Можно полагать, что хроническое иммунное воспаление при ПРС ведет к формированию гетерогенных популяций клеток, одна из которых элиминируется через апоптоз, а другая поддерживает непрерывный полипогенез. Необходимо отметить, что в полипах фиброзного типа пролиферация и гибель клеток незначительна, что также находит подтверждение при исследовании каспазы-3 у пациентов с ПРС [3][10][15].

Баланс про-и антиапоптотических факторов формирует молекулярный «реостат», определяющий динамику и исход хронического иммунного воспаления [7][10][11]. Морфологическим эквивалентом этого баланса является установленное нами соотношение р53/каспаза-3 в тканях полипов. Распространение программированной гибели клеток при ПРС представляет результат регуляции специфических генов, где эпигенетические воздействия остаются определяющими [3]. Потенциальный канал такого взаимодействия может представлять синтез NO.

Нами установлено значительное нарастание активности конститутивной и индуцибельной изоформы NOS в соединительной ткани и эпителии полипов. Повышенная выработка NO в этой ситуации повышает проницаемость сосудистой стенки, усиливает отек подслизистой основы, стимулирует миграцию воспалительных клеток и секрецию слизи в железах и бокаловидных клетках. При развитии ПРС наблюдается общая тенденция к увеличению содержания nNOS-позитивных клеточных элементов на фоне снижения активности маркера в нервных волокнах. Активность маркера обнаруживается в эндотелиоцитах кровеносных сосудов, клетках подслизистой основы и особенно выражена в субэпителиальной зоне. Ключевая роль NO при ПРС в качестве координатора местных нейроиммунных механизмов ремоделирования слизистой оболочки полости носа, что, в свою очередь, и способствует усилению рецидивирования ПРС.

Заключение

Развитие ПРС сопровождается усилением экспрессии NOS и факторов апоптоза в слизистой оболочке полости носа. Особенности специфического сигнального микроокружения обеспечивают особые условия для формирования полипов различного морфологического типа. Исследования разных путей регуляции апоптоза способствует всестороннему пониманию молекулярно-клеточных механизмов повреждения слизистой оболочки полости носа при ПРС и необходимы для разработки новых подходов эффективной терапии данной группы заболеваний.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.