Определение профиля антоцианов и оптимальных параметров их экстрагирования из плодов шикши черной Empetrum nigrum

Фитопрепараты на основе антоцианов являются перспективными для снижения риска развития сердечнососудистых и желудочно-кишечных заболеваний, ожирения и диабета [1], поэтому исследование уникальных и малоизученных в фармакологическом аспекте антоциансодержащих дальневосточных растений является оправданным поиском дополнительных средств для предупреждения вышеназванных состояний. К таким растениям можно отнести вечнозеленый стелющийся кустарничек голарктических и арктических областей семейства вересковых, с круглыми плодами и листьями, похожими на хвоинки – шикшу черную Еmpetrum nigrum [2].

Шикша (водяника, вороника) дикорастущее ягодное растение, хорошо приспособленное к местным условиям, формирует ягоды черного цвета, в которых содержится многокомпонентный комплекс вторичных соединений: антоцианы, флавоноиды, углеводы, эфирное масло, тритерпеновые сапонины, кумарины, дубильные вещества, витамин С, фенолкарбоновые кислоты [2][3]. Антоцианы или антоцианины (водорастворимые гликозиды антоцианидинов) относятся к флавоноидам, находятся в вакуолях, представляют собой водорастворимые пигменты, придающие плодам черную окраску [4][5].

Антиоксидантное, противовоспалительное и сосудоукрепляющее действие плодов шикши черной подтверждено в доклинических и клинических исследованиях. Они способны понижать уровень глюкозы в крови, проявляют противогрибковую и антимикробную активность [6][7].

В результате исследования фармакотерапевтической эффективности сока из плодов шикши черной подтвержден значительный потенциал его компонентов для предотвращения сосудистых нарушений при аллоксановом диабете [8]. Однако дальнейшее изучение фармакологических эффектов антоцианов ограничено ввиду отсутствия данных об условиях их выделения из нативного лекарственного сырья.

Цель настоящей работы состояла в определении профиля антоцианов и оптимальных параметров их экстрагирования из плодов шикши черной.

Материалы и методы

Объектами исследования служили высушенные плоды шикши черной. Заготовка плодов произведена в 2021 году на полуострове Камчатка в период созревания. Установлена подлинность и доброкачественность трех партий сырья. Ягоды шикши водянистые, слегка кислые, имеют вяжущий вкус, рН сока составляет 4,5.

Сочные плоды шикши черной содержат высокое количество воды, обеспечивающее высокий уровень биохимических процессов, поэтому сушили их быстро, с частым перемешиванием, при температуре 60–80 °С [9]. В сухих плодах определяли аналитическую влажность [10].

Для исследования профиля антоцианов использовали сухие плоды шикши черной. Измельченный материал (1,0 г) экстрагировали 2 мл 70% метиловым спиртом с добавлением 2% муравьиной кислоты в течение 30 минут на ультразвуковой бане, затем выдерживали в темноте при комнатной температуре. Через 20 часов полученные экстракты центрифугировали (15 000 g, 10 мин) и фильтровали через 0,45 мкм фильтр (нейлон, Millipore, Bedford, MA, USA). Аликвоту 1 мкл использовали для аналитической хроматографии. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографе 1260 Infinity (Agilent, США) с системой насосов высокого давления Quaternary Pump G1311С, автоинжектором G1329B, термостатом колонок G1316A и детектором на диодной матрице G1315D. Для разделения компонентов экстрактов использовали хроматографическую колонку с обращенной фазой Zorbax C18 (150×2,1 мм, 3,5 мкм, Agilent, США). Подвижная фаза состояла из растворов муравьиной кислоты (1%) в деионизированной воде (А) и в ацетонитриле (Б). Элюирование проводили при температуре 40 °С с постоянной скоростью потока растворителей 0,2 мл/мин с использованием следующего градиента: 0% Б, 0–5 мин; 0–20% Б, 5–35 мин; 20–40% Б, 35–50 мин [11]. Длина волны детектирования составила 520 нм. УФ-спектры записывали в диапазоне длин волн от 200 до 800 нм.

Для идентификации антоцианов использовали тандем ВЭЖХ и масс-спектрометрии (МС) Bruker HCT ultra PTM Discovery System (Bruker Daltonik, GmbH, Германия). Масс-спектрометрический сигнал записывали в режиме ионизации электрораспылением и регистрации положительных ионов в диапазоне значений m/z 100–800. Тандемную масс-спектрометрию проводили в автоматическом режиме при напряжении фрагментации 1 В.

Для определения содержания суммы антоцианов в плодах шикши черной была взята за основу фармакопейная методика стандартизации плодов аронии черноплодной по содержанию антоцианинов [9].

На процесс экстракции оказывают влияние множество факторов [12], поэтому экспериментально, эмпирически определяли оптимальные параметры извлечения антоцианов: экстрагент, соотношение сырья и экстрагента, размер частиц, время экстракции.

Наиболее подходящими экстрагентами для антоцианов являются полярные растворители (водноспиртовые растворы) и подкислители [12]. Степень измельчения сырья также оказывает влияние на полноту экстрагирования, при этом диффузионные процессы обеспечиваются выбором оптимального размера частиц [13].

Экстракция при нагревании способствует деградации антоцианов [11]. Извлечение проводили этиловым спиртом в кислой среде (1% соляная кислота) при постоянном перемешивании, без нагрева (при комнатной температуре).

Количественное определение антоцианов в плодах шикши черной определяли по следующей методике: 1,0 г сырья (точная навеска), измельченного до размера частиц, проходящего сквозь сито 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл и прибавляют 70 мл свежеприготовленного спирта этилового 70%-го, содержащего раствор хлористоводородной кислоты (к 100 мл 70% этанола приливают по каплям 1,0 мл концентрированной хлористоводородной кислоты). Извлечение антоцианов проводят при комнатной температуре в течение 90 мин при постоянном перемешивании. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр в колбу темного стекла (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1,0 мл раствора А, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (раствор Б).

Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 534 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт 70%-ный, содержащий хлористоводородную кислоту.

Количественное содержание антоцианов в исследуемых образцах рассчитывали по формуле:

где А – оптическая плотность раствора Б;

 – удельный показатель поглощения× цианидин3-О-гликозида при длине волны 534 нм, равный 100;

а – навеска сырья, г;

W – влажность сырья, %

Результаты экспериментов статистически обработаны согласно требованиям ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» ГФ XIV издания с использованием критерия Стьюдента (t) и c расчетом средних арифметических и доверительного интервала стандартного отклонения (s) и относительной ошибки методов количественного определения (ε) [9].

Результаты иccледования

Полученное извлечение анализировали с использованием аналитического оборудования ЦКП «Биотехнология и генетическая инженерия» ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН. ВЭЖХ-УФ профиль извлечения, записанный при λ = 520 нм (рис. 1 а), показал наличие 8 компонентов, характеризующихся как антоцианы. Идентификацию компонентов проводили путем сравнения полученных данных: последовательности элюирования компонентов, УФи МСпараметров (рис. 1, табл. 1) с ранее опубликованными для семейства Еmpetrum [14].

Для определения оптимальных параметров извлечения антоцианов из плодов шикши были выбраны экстрагенты следующей концентрации: спирт этиловый 40, 70 и 95%. Результаты эксперимента показывают целесообразность использования спирта этилового 70% (табл. 2).

Для определения соотношения сырья и экстрагента использовали различные количества этанола при постоянном весе навески (1,0 г) (табл. 3).

Изучение степени измельченности плодов шикши показывает, что максимальная экстракция антоцианов происходит при размерах частицы, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм (табл. 4).

Извлечение антоцианов из плодов шикши проводилось без нагревания, при постоянном перемешивании в течение 60, 90 и 120 минут.

Результаты исследования показывают, что максимальная экстракция антоцианов из плодов шикши происходит в течение 90 минут (табл. 5).

В результате проведенных экспериментов установлены оптимальные условия экстракции антоцианов из плодов шикши черной: экстрагент – спирт этиловый 70%, размер частиц 1,0 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:70, время экстракции 90 минут.

Количественное содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в плодах шикши черной составляет 5,65 ± 0,04% (табл. 6).

Обсуждение полученных данных

Антоцианы, содержащиеся в кожуре плодов шикши, активно препятствуют окислительному стрессу клеток организма, снижают перекисное окисления липидов, уменьшают проницаемость и хрупкость капилляров и укрепляют мембраны, обладают гипогликемической и гиполипидемической активностью [5][6].

В экспериментах использовали экстракционные методы выделения антоциановых комплексов как наиболее информативные. Получение окрашенных форм антоцианов зависит от кислотности создаваемой среды (pH ≤ 1). В сильнокислых растворах антоцианы находятся в окрашенной флавилиевой форме, при повышении pH флавилиевая форма переходит в малоустойчивую бесцветную форму псевдооснования. Именно окрашенные антоцианы проявляют высокую антиоксидантную активность [14].

Для разделения смесей и идентификации антоцианов использовали тандем ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Из 20 наиболее известных антоцианидинов наиболее широко распространены: пеларгонидин, цианидин, дельфинидин и мальвидин.

В плодах шикши превалируют компоненты цианидинового (33,068% ± 7,889%), мальвидинового (15,374% ± 1,640%) и дельфинидинового (21,733%) ряда, также обнаружены в незначительных количествах компоненты пеонидина (8,641% ± 2,504%) и петунидина (9,150%).

Для определения суммарного содержания антоцианов в исследуемых образцах использовали спектрофотометрический метод с пересчетом на цианидин3-глюкозид (5,65 ± 0,04%). Во избежание гидролиза гликозидных связей в процессе экстракции не допускается нагревание экстрагента. Полученный экстракт наряду с мономерными антоцианами также содержит их полимерные формы. Дифференциальный спектрофотометрический метод применяется для определения именно мономерных антоцианов в сырье [14].

Окрашенные флавилиевые формы антоцианов, устойчивые в сильнокислой среде, определяли при длине волны 534 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Изучение оптимальных параметров экстрагирования антоцианов подтверждает специфичность их для каждого вида сырья. В работе были изучены некоторые технологические параметры выхода антоцианов из плодов шикши. Лучшим экстрагентом является водно-спиртовая смесь с содержанием спирта этилового 70% при соотношении сырье/экстрагент 1:70.

Оптимальным является измельчение плодов до размера частиц, проходящих сквозь сито диаметром 1 мм. Более крупные частицы сырья содержат мелкие семена, которых в плодах (ягодообразной многокосточковой костянке) от 6 до 11 штук. При измельчении сырья до частиц размером 0,5 мм в процессе экстракции растительного материала происходит разрушение клеток балластных веществ и дальнейшее их набухание [6]. Наиболее результативной является экстракция антоцианов из плодов шикши на протяжении 90 минут. Более продолжительное время экстракции способствует набуханию нестабильных и реакционноспособных антоциановых пигментов [14].

Выводы

В плодах шикши черной содержатся следующие компоненты антоцианов: дельфинидин-3-галактозид (21,733%), цианидин-3-галактозид (33,068%), петунидин-3-галактозид (9,150%), цианидин-3-арабиноза (7,889%), пеонидин-3-арабиноза (2,504%), мальвидин-3-галактозид (15,374%), пеонидин-3-арабиноза (2,504%), мальвидин-3-арабиноза (1,640%).

Экспериментально найдены оптимальные условия экстракции антоцианов из плодов шикши черной: экстрагент – этанол 70%-ный; навеска 1,0 г; размер частиц 1,0 мм; соотношение сырья и экстрагента 1:70; время экстракции 90 минут.

Определено содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в плодах шикши черной – 5,65 ± 0,04%.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования – СГП, ААС, ВПГ
Сбор и обработка материала – СГП, ААС
Статистическая обработка – СГП, НВП
Написания текста – СГП, ААС, ЛВУ
Редактирование – ЛВУ, ВПГ, НВП