Антибактериальное и антибиопленочное действия бактериофагов в отношении Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa, выделенных от пациентов с ортопедической инфекцией

Антибиотикорезистентность является значительной и широко обсуждаемой проблемой системы здравоохранения [1][2]. В 2019 г. было зарегистрировано 4,95 млн случаев смерти, связанных с бактериальной устойчивостью, в том числе 1,27 млн летальных исходов, напрямую вызванных антибиотикорезистентными штаммами [3].

Во второй половине ХХ века фаготерапию ограниченно применяли только в СССР и Польше, а вопрос о регистрации препаратов с вариабельным составом бактериофагов перед регуляторами фармацевтического рынка не возникал [4]. Отсутствие общепринятых подходов является существенной преградой для выхода фагов на мировой фармацевтический рынок. Бактериофаги по-прежнему не имеют одобрения на фармакологическом рынке западной медицины в качестве зарегистрированного лекарственного средства, но все чаще используются в качестве персонализированной терапии для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями [1][2].

Инфекции костей и суставов после травм и ортопедических операций являются особой формой глубокой локализованной инфекции, которая с учетом высокой частоты хронизации и слабого ответа на антибиотики, представляет потенциальную мишень для бактериофагов. В 10–20% случаев причиной таких инфекционных осложнений являются грамотрицательные патогены [5]. Наличие у бактерий различных механизмов резистентности к антибиотикам, а также формирование микробных биопленок на поверхности имплантированных ортопедических конструкций и на окружающих тканях могут приводить к неэффективности проводимой антибактериальной терапии.

Хотя ведущими возбудителями инфекции, ассоциированных с ортопедическими имплантатами, являются стафилококки, участие в этиологии грамотрицательных возбудителей, включая Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa, служит прогностически неблагоприятным признаком [5]. Это связано с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам К. pneumoniae и P. aeruginosa [5]. При этом наличие резистентности к бета-лактамам и фторхинолонам делает невозможным назначение пролонгированной этиотропной антибактериальной терапии, которая является стандартной для лечения инфекции костей и суставов ввиду отсутствия других пероральных препаратов, активных в отношении грамотрицательных патогенов.

Бактериофаги, воздействуя на сессильные бактерии, способны разрушать и/или предотвращать образование биопленки путем проникновения в ее структуру по водным каналам. Установлено, что большинство фагов продуцируют деполимеразы, способные гидролизовать компоненты матрикса бактериальных биопленок [1][6][7].

Цель исследования – оценить чувствительность К. pneumoniae и P. aeruginosa к препарату поливалентного бактериофага (ПБФ) и его влияние на биопленкообразование и сформированную биопленку изолятов, выделенных от пациентов с ортопедической инфекцией.

Материалы и методы

Исследование носило проспективный характер, в него включали клинические штаммы, выделенные подряд из биоматериала пациентов с перипротезной инфекцией и/или остеомиелитом в 2021 г. Всего протестировано 100 клинических изолятов: K. pneumoniae – 50, P. aeruginosa – 50. Выделение культур проводили в соответствии со стандартными ручными методиками, принятыми в лаборатории. Материалом для исследования служили тканевые биоптаты, раневое отделяемое, синовиальная жидкость и удаленные металлоконструкции, полученные от пациентов, находящихся на стационарном лечении. Видовую идентификацию выполняли методом MALDI-TOF-MS с использованием системы FlexControl и программного обеспечения MBT Compass 4.1 (Bruker Daltonics, Германия), Score ≥ 2,0. Чувствительность изолятов к антибактериальным препаратам изучали в соответствии с требованиями EUCAST v.21.

Бактериальную ДНК выделяли с использованием набора «ДНК-Сорб-АМ», согласно инструкции производителя (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Детекцию генов приобретенных карбапенемаз групп KPC/OXA-48 иметалло-бета-лактамаз осуществляли методом Real-time PCR (ПЦР-РВ) с использованием наборов реагентов с гибридационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL» и «АмплиСенс MDR MBL-FL» («Интерлабсервис», Россия) на приборе «Амплификатор Real-time CFX96 Touch» (BioRAD, США).

Наличие чувствительности к препарату «Секстафаг» пиобактериофаг поливалентный («Микроген», Россия) определяли на мясо-пептонном агаре (МПА). Бактериальную взвесь (0,5 по МсF) ватным тампоном наносили на МПА и через 10 минут на поверхность агара дозатором наносили 10 мкл ПБФ в дубликатах. Чашки инкубировали при 37 °С 18 часов (рис. 1).

Биопленки формировали по методу O’Toole. Планшеты инкубировали 24 часа при 37 °С, затем промывали, высушивали и опытные лунки обрабатывали 200 мкл ПБФ (контрольные – LB-бульон). Через 24 часа лунки промывали, высушивали и окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией (96% этанол). Биомассу пленок оценивали по оптической плотности полученных экстрактов при 570 нм (Spectrostar Nano).

Полученные данные анализировали с использованием программы Statistica (v.13). Оценку нормальности распределения значений выполняли тестом Шапиро – Уилка (W-тест), а сравнение количественных показателей – при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования

Типовые штаммы K. pneumoniae ATCC 33495 и P. aeruginosa ATCC 27853 характеризовались чувствительностью к бактериофагам (рис. 2), о чем свидетельствует статистически значимое снижение оптической плотности МХБ со взвесью бактерий при совместной инкубации с бактериофагами (р < 0,001).

Среди изученных 50 клинических культур K. pneumoniae 7 штаммов (14%) характеризовались устойчивостью к карбапенемам. Для 6 карбапенем-резистентных K. pneumoniae регистрировали наличие гена металло-бета-лактамаз группы NDM (bla_NDM), при этом один изолят продуцировал и сериновые карбапенемазы OXA-48 (bla_OXA-48). Из 50 изолятов P. aeruginosa – 15 (30%) демонстрировали резистентность к кабапенемам, из них 4 были продуцентами VIM-карбапенемаз (bla_VIM).

Доля чувствительных к бактериофагам штаммов K. pneumoniae составила 36% (18 из 50), в том числе 1 карбапенем-резистентный изолят – продуцент NDM-карбапенемазы. Штаммы P. aeruginosa были чувствительны к фагам в 56% случаев (28 из 50) (рис. 2), включая 3 из 15 карбапенем-резистентных штамма, при этом для данных культур не выявлено наличие генов VIM-карбапенемаз.

Сравнительный анализ активности фагов в отношении штаммов P. aeruginosa с различным профилем антибиотикочувствительности показал, что среди 35 чувствительных к карбапенемам изолятов 69% были чувствительны и к бактериофагам. В тоже время фаги были эффективны лишь в отношении 20% карбапенем-устойчивых культур.

Все фагочувствительные изоляты K. pneumoniae (n = 18) и P. aeruginosa (n = 28) характеризовались биопленкообразующей способностью различной степени (рис. 3).

Подавляющее большинство штаммов K. pneumoniae обладали слабой способностью формировать биопленки – 83%. Все культуры P. aeruginosa демонстрировали умеренную степень биопленкообразования.

ПБФ ингибировал формирование биопленок у 83 и 96% изолятов K. pneumoniae и P. aeruginosa соответственно (рис. 4). При этом снижение биомассы биопленок более чем на 80% было зарегистрированодля 11% культур K. pneumoniae и 61% – P. aeruginosa. Следует отметить, что для карбапенем-резистентного штамма K. pneumoniae не выявлено ингибирование биопленкообразования в присутствии бактериофага. Совместная инкубация фагов и устойчивых к карбапенемам P. aeruginosa приводила к замедлению формирования биопленки на 84%.

ПБФ снижал биомассу сформированной суточной биопленки у 78% изученных изолятов K. pneumoniae и 68% – P. aeruginosa, однако деструкция пленки более чем на 80% была выявлена лишь у 4 и 6% штаммов соответственно (рис. 5). При этом для карбапенем-резистентных P. aeruginosa снижение биомассы сформированных пленок относительно контроля составило в среднем 30%, а для NDM-продуцирующего изолята K. pneumoniae – 40%.

Обсуждение полученных данных

Антибактериальный эффект препаратов бактериофагов обусловлен внедрением генома фага в бактериальную клетку с последующим его размножением и лизисом инфицированной клетки [6]. Вышедшие во внешнюю среду в результате лизиса бактериофаги повторно инфицируют и повреждают другие бактериальные клетки, действуя до полного уничтожения патогенов в очаге воспаления [6][7]. Д.В. Тапальский исоавт. [8][9] показали, что чувствительными к препарату «Секстафаг» были 24,1% клинических изолятов P. aeruginosa и 24,8% штаммов K. pneumoniae. Авторы установили, что уровень литической активности препаратов бактериофагов в 1,3–2,6 раза ниже в отношении экстремально резистентных к антибиотикам изолятов P. aeruginosa в сравнении с чувствительными. В нашем исследовании чувствительностью к ПБФ характеризовались 36% штаммов K. pneumoniae и 56% P. aeruginosa. В отношении карбапенем-устойчивых штаммов K. pneumoniae и P. aeruginosa активность бактериофагов составила 14 и 20% соответственно.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой на различных этапах биопленкообразования включает предотвращение бактериальной адгезии и колонизации, замедление роста и созревания биопленки. Этот эффект дополняет антибактериальное действие в отношении патогенов, приводящее к увеличению числа фагов внутри биопленки [10]. Бактериофаги способны проникать в биопленки, образованные штаммамис различной степенью восприимчивости к вирусам и способностью к биопленкообразованию [11]. Причем в более 50% случаев фаги эффективно препятствуют формированию биопленки P. aeruginosa [12]. В соответствии с нашими результатами большинство фагочувствительных культур P. aeruginosa замедляли биопленкообразование в присутствии ПБФ. Для 61% изолятов это снижение составило более 80% по сравнению с контролем. При этом меньший эффект был зарегистрирован в отношении формирования биопленок K. pneumoniae.

Вследствие низкой эффективности антибиотикотерапии инфекций, связанных с формированием биопленок, возрастает интерес к фагам в качестве перспективных средств для эрадикации возбудителей, находящихся в ее составе. Бактерии, расположенные в более глубоких слоях, в условиях крайне ограниченного доступа кислорода и питательных веществ замедляют свою метаболическую активность, что снижает эффективность большинства антибиотиков и ведет к низкой репликации фагов [1][6]. Результаты выполненного исследования показали снижение биомассы суточных биопленок под действием ПБФ у78 и 68% клинических изолятов K. pneumoniae и P. aeruginosa соответственно, однако деструкцию пленки выше 80% регистрировали лишь у нескольких штаммов каждого вида. Известно, что бактериофаг vB_KpnP_FZ12 разрушал структуру биопленки и кластеров K. pneumoniae, а также сокращал общее число бактерий в биопленке [13]. S.A. Fong и соавт. [14] использовали бактериофаги для эрадикации биопленок P. aeruginosa, выделенных от пациентов с хроническим риносинуситом [14]. Авторы установили, что препараты отдельных фагов уменьшали биомассу биопленок изолятов на 53–73%, а применение фагового «коктейля» – на 89%. При этом множественная лекарственная устойчивость P. aeruginosa не влияла на антибиопленочную активность всех четырех фагов [14]. В нашем исследовании обнаружено ингибирование биопленкообразования карбапенем-резистентных штаммов P. aeruginosa под действием ПБФ.

Заключение

Коммерческий препарат поливалентного пиобактериофага был активен в отношении 36 и 56% штаммов K. pneumoniae и P. aeruginosa соответственно, включая 1 из 6 и 4 из 15 карбапенем-устойчивых изолятов. Большинство изученных штаммов обоих видов бактерий снижали продукцию биопленок при совместной инкубации с поливалентным фагом, однако снижение биомассы более 80% выявлено для P. aeruginosa. Воздействие бактериофага на уже сформированные биопленки было менее выраженным, несмотря на снижение биомассы биопленок у 78 и 68% штаммов K. pneumoniae и P. aeruginosa соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований, посвященных изучению активности бактериофагов в отношении возбудителей ортопедической имплантат-ассоциированной инфекции, и разработки методов фаготерапии для лечения профильных пациентов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.