Возможности оценки васкулогенной мимикрии на доклиническом этапе исследований соединений с предполагаемым противоопухолевым действием

Злокачественные новообразования являются социально значимой проблемой в России и в мире в целом. Одним из основных показателей, определяющих прогноз онкологического заболевания, является степень распространенности опухолевого процесса на момент его выявления. К сожалению, данный показатель остается стабильно высоким [1]. В связи с этим актуальной задачей междисциплинарных исследований является уточнение фундаментальных патогенетических механизмов процесса метастазирования, выяснения факторов, способствующих и ингибирующих рост вторичных опухолевых очагов в отдаленных органах и тканях.

Активность диссеминации злокачественных новообразований во многом определяет прогноз при лечении у пациентов с опухолями различных локализаций. Распространение атипичных клеток из первичного очага и последующий рост новых опухолевых колоний в тканях – это многоступенчатый процесс, известный как метастатический каскад. Эта последовательность событий включает в себя локальную инвазию первичных опухолевых клеток в окружающие ткани; интравазацию этих клеток и их внедрение в систему кровообращения (важно также выживание клеток при гематогенном транзите); остановку и экстравазацию через стенки сосудов в паренхиму отдаленных тканей; образование микрометастатических колоний в этой паренхиме; последующий рост микроскопических колоний до размеров выявляемых клинически метастатических очагов с активацией неоваскулогенеза в опухолевой ткани [2].

Опухолевой ангиогенез является ключевым фактором, связанным с ростом, прогрессированием и метастазированием опухоли [3]. Рост опухолей зависит от интенсивности роста кровеносных и альтернативных сосудов для снабжения кислородом и питательными веществами [4]. Ангиогенез в широком понимании – процесс формирования новых сосудов из существующих – обеспечивает расширение и ремоделирование сосудистой сети [5].

Цель: обсудить механизм васкулогенной мимикрии и предоставить рекомендации для изучения процесса на доклиническом этапе исследования соединений с предполагаемым противоопухолевым действием.

Васкулогенная мимикрия (ВМ) – это процесс, обнаруживаемый во многих злокачественных опухолях, отличающийся от традиционного неоангиоваскулогенетического прогрессирования с участием эндотелия сосудов. Данный феномен проявляется как альтернативный тип кровоснабжения, независимый от эндотелиальных сосудов и обусловленный образованием новых сосудов, выстланных опухолевыми клетками [6]. ВМ напрямую связана с инвазией опухоли и ее метастазированием [7][8][9] и обнаруживается при высокоинвазивных, агрессивно метастатических и запущенных злокачественных опухолях [10].

Формирование ВМ включает в себя самодеформацию высокозлокачественных опухолевых клеток, ремоделирование внеклеточного матрикса и, как следствие, образование сосудоподобной структуры, которая связана с существующими кровеносными сосудами [11].

Выделяют 2 типа ВМ (рис.): трубчатый и тип матрицы с рисунком [12][13].

Трубчатая структура состоит из опухолевых клеток и покрыта секретируемыми гликопротеинами. Описан ряд механизмов формирования структур подобного типа, таких как формирование путей через опухолевую ткань и инвазия стенок сосудов опухолевыми клетками [14].

Тип матрицы с рисунком имеет протоки, которые состоят из внеклеточного матрикса вместо клеток и представляет собой круговую сеть, образованную стромальным слоем, окружающим скопление опухолевых клеток. Эти слои расположены неравномерно, и в результате транспорт жидкости вокруг скоплений клеток неравномерен. Такая структура обеспечивает большую площадь диффузионной поверхности, чем трубчатая, облегчая доставку питательных веществ и кислорода к опухолевым клеткам [11]. Тип матрикса с рисунком включает опухолевые клетки и ткани, которые обернуты вокруг PAS(ШИК)-положительных матриксных белков, таких как ламинин, протеогликан гепарансульфата и коллагены IV и VI [15].

Выделяют также смешанный тип структур. При переходе от эндотелийзависимых сосудов к имитированным сосудам мозаичные сосуды встречаются как переходный тип между эндотелийзависимыми сосудами и каналами ВМ, при этом в васкуляризации опухоли участвуют как эндотелий хозяина, так и опухолевые клетки [16].

В настоящее время доступно несколько методов для выявления ВМ in vivo, но «золотым стандартом» по-прежнему остается иммуногистохимическое окрашивание специфических антигенов [17][18].

Структуры ВМ описываются как высокоперфузионные, богатые матриксом трубчатые или матриксные структуры, содержащие коллаген, протеогликаны гепарансульфата и плазму. В отличие от традиционного ангиогенеза, ВМ характеризуется плотным отложением опухолевых клеток и внеклеточного матрикса. Гликопротеины, образующие эти структуры, включают коллаген I, IV и VI типов, а также ламинин Ln5 и продукты его расщепления [19]. Сосудистые каналы в ВМ имеют несколько общих характеристик с эндотелийзависимой сосудистой сетью; однако их отличительные особенности выражены существенно. Например, эндотелиальные клетки экспрессируют сосудистый эндотелиальный (VE)-кадгерин, также известный как CD144, основную молекулу, связанную с межклеточной адгезией в эндотелиальных адгезивных соединениях. Однако в атипичных клетках, способных образовывать ВM, VE-кадгерин экспрессируется аберрантно и, по-видимому, участвует в другой функции, а именно в приобретении трубкообразных структур [20].

Уникальное расположение сеток ВМ имитирует эмбриональный васкулогенез. Предполагается, что злокачественные опухолевые клетки в процессе развития приобретают эмбриональный фенотип. Анализ экспрессии генов показал, что агрессивные опухолевые клетки, способные к ВМ, демонстрируют разнообразный профиль генов, экспрессируя гены из нескольких типов клеток, таких как эпителиальные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки [21].

Кадгерин эндотелия сосудов (VE-кадгерин), также известный как кадгерин 5 или CD144, представляет собой белок межклеточной адгезии, обычно экспрессируемый эндотелиальными клетками. Фосфорилирование VE-кадгерина по ряду аминокислотных остатков может модулировать стабильность и проницаемость эндотелиального соединения в различных контекстах [22].

Фактически, VE-кадгерин был обнаружен в высокоагрессивных опухолевых клетках, но он не экспрессировался их малоагрессивными аналогами. Более того, понижающая регуляция VE-кадгерина приводит к ингибированию образования ВМ [23].

Опухолевые клетки, участвующие в ВМ, напоминают мезенхимальные клетки, полученные в результате перехода от эпителия к мезенхиме, который характеризуется понижающей регуляцией эпителиальных маркеров (например, цитокератина), потерей клеточной полярности (Е-кадгерин, окклюдин) и усилением регуляции мезенхимальных маркеров (виментин, N-кадгерин, фибронектин) [15]. Кроме того, эти клетки ВМ имеют эндотелиальный фенотип [14][20][24].

ВМ может представлять собой важный механизм выживания опухоли и способствовать неэффективности современной антиангиогенной терапии, направленной на полное лишение опухолей кровоснабжения [25]. ВМ часто наблюдается в областях между опухолью и окружающими нормальными тканями [26].

Выделены основные критерии диагностирования структуры ВМ [27]:

1. отсутствие эндотелиальных клеток сосудов на внутренней стенке кровеносного сосуда ВМ;
2. сосудоподобные каналы выстланы опухолевыми клетками;
3. положительный результат при окрашивании PAS

(ШИК), но отрицательный при окрашивании CD31/ CD34, в то время как эндотелиальные сосудистые каналы отрицательный для окрашивания PAS (ШИК), но положительный для окрашивания CD31/ CD34; 4) эритроциты в сосудистых каналах.

Краткая характеристика маркеров для гистологического и иммуногистохимического анализа ВМ представлена в таблице.

Авторы двойного окрашивания (PAS+CD31/34^–) эндотелиального маркера CD34 для идентификации эндотелия в срезах ткани и окрашивания PAS для определения базальной мембраны кровеносных сосудов опухоли сравнили специфичность и интенсивность визуализации CD34 и CD31 для определения эндотелия при астроцитоме и обнаружили, что CD34 приводит к более четкому мечению и более легкому определению эндотелия, чем CD31 [29][30].

В настоящее время не существует безошибочного биомаркера для идентификации каналов ВM, но были описаны некоторые специфические характеристики и экспрессия конкретных маркеров, связанных с этими клеточными структурами [31].

По нашему мнению, наличие CD31/CD34негативных и PAS-позитивных клеток, а также эритроцитов в сосуде может быть использовано в качестве критериев идентификации ВМ в процессе доклинического изучения соединений с предполагаемым противоопухолевым действием.

Сначала проводят окрашивание CD31/CD34 с использованием моноклонального антитела для идентификации эндотелиальных клеток, а затем инкубируют с периодической кислотой Шиффа (PAS) для маркировки базальной мембраны трубчатых структур [32]. Для иммуногистохимического окрашивания CD31 эндотелийзависимые сосуды (EVs) оцениваются путем подсчета CD31-позитивных сосудов в 10 случайно выбранных полях [33]. Каналы, образованные опухолевыми клетками при ВМ, могут не окрашиваться различными иммуногистохимическими маркерами эндотелиальных клеток совсем или окрашиваться прерывистым образом [34]. Изучение данных диагностических критериев ВМ в эксперименте позволит разработать новые стратегии снижения вторичной диссеминации опухолевых клеток.

Выводы

Для доклинической разработки новых субстанций с предполагаемым противоопухолевым действием необходимо оценивать влияние тестируемых соединений на активность классического и альтернативного неоангиогенеза. Хотя конкретный механизм, лежащий в основе индукции ВМ, еще не полностью выяснен, стратегия изучения данного процесса в эксперименте позволит разработать новые отечественные противоопухолевые и антиметастатические лекарственные средства с мультифакторным механизмом действия.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ИМК

Сбор и обработка материала – ААМ, СИС, МДЕ, ВВТ

Написание текста – МВГ, МАД Редактирование – ИМК