Сравнительная оценка активности лизостафина против Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis и их биопленок

Хотя техника медицинских и хирургических манипуляций совершенствуется, стафилококки остаются основными бактериями, вызывающими широкий спектр заболеваний [1]. Несмотря на варьирование соотношения частоты выделения патогенов, Staphylococcus aureus и S. epidermidis занимают лидирующие позиции не только среди всех видов стафилококков, но и в структуре возбудителей имплантат-ассоциированной инфекции в травматологии-ортопедии в целом. В нашем исследовании 2024 года показано, что в течение 12-летнего периода в 33% случаях возбудителями ортопедической инфекции были S. aureus, в 19% – S. epidermidis [2]. Аналогичные данные представили А.В. Цискарашвили и соавт., показав, что в течение 6 лет в структуре ведущих возбудителей перипротезной инфекции доля S. aureus составила 31,9 %, S. epidermidis – 20% [3].

В дополнение к хорошо известным генетическим механизмам, лежащим в основе устойчивости стафилококков к антибиотикам, эти бактерии способны демонстрировать и другие стратегии противостояния воздействию противомикробных препаратов, одна из которых – формировать биопленки. Стафилококковые биопленки являются основной причиной развития инфекций, связанных с установкой различных имплантатов в травматологии и ортопедии, в стоматологии и кардиологии [4]. После образования биопленки на имплантированном медицинском устройстве или поврежденной ткани ее трудно разрушить. Имплантированный суставной протез является бессосудистым, а область контакта кости и протеза относительно слабо васкуляризирована, поэтому инфекции могут развиваться несмотря на все усилия по профилактике, трудно поддаются лечению и в подавляющем большинстве случаев требуют удаления инфицированной металлоконструкции или эндопротеза, а также всех пораженных тканей для купирования инфекции. Современные подходы к антимикробной терапии инфекций, связанных с биопленками, в значительной степени оказались безуспешными, и необходима разработка дополнительных методов для эффективной элиминации возбудителя из инфекционного очага.

Антимикробная пептидаза лизостафин, бактериоцин класса III, является Zn-зависимой антибактериальной эндопептидазой, вырабатываемой Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus [5]. Лизостафин эффективен против активно растущих стафилококков и бактерий со сниженной метаболической активностью за счет деструкции пептидогликана их клеточной стенки [5][6]. Определенный интерес представляют исследования возможного применения лизостафина для профилактики развития и лечения уже существующих инфекционных заболеваний, вызванных различными видами стафилококков.

Цель исследования – сравнительная оценка активности фермента лизостафина против S. aureus и S. epidermidis, выделенных от пациентов ортопедического профиля, и их биопленок.

Материалы и методы

Для выполнения исследований фермент лизо-стафин был получен генно-инженерным методом [7]. Протестировано 120 клинических штаммов стафилококков, фенотипически различных S. aureus (n = 60) и S. epidermidis (n = 60), выделенных в 2023 г. Идентификацию выделенных культур выполняли методом Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ion-ization Time-of-Flight Mass Spectrometry (Score ≥ 2,0). Чувствительность к различным антибактериальным препаратам изучали в соответствии с EUCAST v.13 дискодиффузионным методом, а также Е-тестом.

Антистафилококковое действие в отношении эталонных штаммов метициллин-чувствительного S. aureus ATCC 29213 (MSSA), метициллин-резистентного ATCC 43300 (MRSA), метициллин-чувствительного S. epidermidis ATCC 12228 (MSSЕ), метициллин-резистентного S. epidermidis ATCC 29887 (MRSЕ) определяли кинетическим исследованием (SPECTROstar NANO) в течение суток с периодичным измерением оптической плотности (ОП) МХБ (бульон Мюллера – Хинтона) с бактериями (0,5 McF) и различным содержанием лизостафина (0,125 до 16 мг/л) при 37 °С. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) изучали методом серийных разведений в МХБ (от 0,06 до 512 мг/л). Сравнительная оценка действия лизостафина на образование биопленок выполнена путем внесения в лунки 96-луночного планшета 180  мкл бульона LB с 1% глюкозы и лизостафина (от 0,25 до 512  мг/л). Далее в питательную среду добавляли взвесь стафилококков (1 × 10⁸ КОЕ/мл). Планшеты инкубировали в течение суток при 37 °С, затем дважды промывали и окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета (20 минут) с последующей спиртовой экстракцией. Результаты оценивали по ОП полученных экстрактов (570 нм). Концентрацией предупреждения образования биопленки BPC (biofilm prevention concentration) считали наименьшую концентрацию фермента, при которой ОП экстрактов генцианвиолета опытных лунок не имела статистической значимой разницы с ОП лунок отрицательного контроля с питательной средой без бактерий.

Для формирования биопленок в лунки планшета вносили 180 мкл бульона Luria-Bertani (LB) с 1% глюкозы и 20 мкл взвеси суточной культуры бактерий (0,5 по шкале МакФарланда). Через 24 часа среду сливали, лунки промывали, обрабатывали лизостафином (0,125–256 мг/л) и оставляли на 2 часа. Далее промывали и добавляли в лунку водный раствор резазурина, инкубировали 2 часа в темноте при 37 °С. За значение MBIC (minimal biofilm inhibitory concentration) принимали наименьшую концентрацию лизостафина, при которой не регистрировали изменение окраски резазурина с синего на розовый.

Для определения MBEC (minimal biofilm eradication concentration) сформированные по методике описанной выше биопленки обрабатывали лизостафином (от 4 до 256 мг/л) в течение 24 часов, а замет промывали и окрашивали. За значение MBEC принимали наименьшую концентрацию, при которой ОП с экстрактами генцианвиолета опытных лунок не имела статистической значимой разницы с ОП лунок отрицательного контроля. Для всех показателей рассчитывали минимальные концентрации, ингибирующие 50 и 90% бактериальных штаммов или их биопленок. Полученные данные были проанализированы в программе GraphPad Prism 9.0 с использованием t-теста. Значения p < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

Выполненное кинетическое исследование показало, что среди протестированных эталонных штаммов более восприимчивыми к действию лизостафина были S. aureus, чем S. epidermidis (рис.). МИК лизостафина в отношении S. aureus АТСС 29213 (MSSA) составила 0,06 мг/л, для S. aureus АТСС 43300 (MRSA) – 0,125 мг/л. S. epidermidis АТСС 12228 (MSSE) – 2 мг/л, S. epidermidis АТСС 29887 (MRSE) – 0,5 мг/л.

В отношении всех клинических штаммов S. aureus МИК варьировали от 0,03 до 0,5 мг/л (табл. 1). Показано, что фенотип чувствительности культур к антибактериальным препаратам не оказывал влияния на чувствительность стафилококков к лизостафину, однако лизостафин был в 2 раза более активен против MSSA, чем против MRSA.

В отношении клинических культур MSSE также регистрировали более выраженную активность лизо-стафина, чем против MRSE, но показатель МИК90 был одинаков для всех штаммов данного вида. Отмечено, что лизостафин был значительно активнее в отношении S. aureus, чем S. epidermidis. Так, МИК90 лизостафина был в 4 раза выше для представителей КОС.

Лизостафин в тестируемых концентрациях активно ингибировал процесс биопленкообразования эталонными штаммами, а также предотвращал образование биопленок всеми клиническими культурами стафилококков. При этом фермент проявлял большую активность в отношении S. aureus (табл. 2). Так, показатель BPC для культур S. aureus определяли в 2–4 раза ниже, чем для S. epidermidis. Концентрация лизостафина 4 мг/л полностью предотвращала биопленкоформирование практически у всех клинических изолятов.

Установлено, что для предупреждения формирования биопленок, устойчивых к метициллину S. aureus, требовалась большая концентрация лизо-стафина, и показатель BPC50/90 для штаммов MRSA был в 2 раза выше, при этом аналогичных различий для S. epidermidis не выявлено.

В экспериментах по оценке минимальной концентрации, ингибирующей биопленку (MBIC), установлено, что наибольшее влияние лизостафин оказывал на MSSE, и концентрация 4 мг/л вызывала гибель стафилококков в составе суточной биопленки у 90% метициллин-чувствительных S. epidermidis (табл. 2). В свою очередь показатель MBIC90 лизостафина был в 4 раза выше для MRSE и в 2 раза выше для S. aureus вне зависимости от их чувствительности к метициллину.

В соответствии с полученными минимальными концентрациями эрадикации биопленки (MBEC) установлено, что активность лизостафина против биопленок S. aureus в 32 раза выше, чем в отношении биопленок S. epidermidis (табл. 2).

Обсуждение

Стафилококки характеризуются наличием значительного количества факторов патогенности и персистенции [4]. Кроме того, все чаще регистрируют штаммы, устойчивые к антибактериальным препаратам, и лизостафин является одним из перспективных антистафилококковых агентов [8][9]. В нашем исследовании все протестированные клинические изоляты стафилококков показали чувствительность к данному ферменту. В своей работе X. Yang и соавт. установили, что все протестированные штаммы стафилококков (n = 257) были восприимчивы к действию фермента и МИК регистрировали в диапазоне концентраций лизостафина от 0,03 до 2 мкг/мл [10].

Эффективность действия ферментных агентов связана с наличием субстрата действия, именно поэтому лизостафин как представитель группы эндопептидаз демонстрирует различную активность против матрикса биопленок разных видов стафилококков. В нашем исследовании показаны различия по трем сравниваемым показателям действия лизостафина на стафилококковые биопленки, что может быть связано с различными компонентами продуцируемого матрикса у S. aureus и S. epidermidis. Матрикс биопленок стафилококков состоит из полисахаридов, белков, тейхоевых кислот и экстрацеллюлярной ДНК [4]. Процентное соотношение компонентов матрикса варьирует, однако в настоящее время установлено, что преобладание какого-либо из компонентов не зависит от вида и является штаммовой характеристикой [4][11][12]. Несмотря на это, существуют закономерности, позволяющие предположить состав матрикса определенного вида стафилококков. По полученным нами данным четко прослеживается активность лизостафина именно против биопленок S. aureus, основной компонент матрикса которых состоит из белковых компонентов. В ряде исследований показано, что MRSA и клинические изоляты S. epidermidis продуцируют белковый матрикс, в то время как MSSA чаще демонстрируют PIA-зависимый тип биопленкообразования, однако данные нашего исследования позволяют предположить явные различия состава матрикса протестированных штаммов S. aureus и S. epidermidis.

Биоактивные соединения, направленные на разрушение биопленки, подразделяют на две категории: вещества, разрушающие матрикс биопленки, и вещества, активные в отношении бактерий, встроенных в биопленку, включая метаболически неактивные клетки [19]. Результаты выполненного нами экспериментального исследования с резазурином показали значительное ингибирование биопленок S. aureus и S. epidermidis через 2 часа инкубации с лизостафином в концентрации до 16 мг/л, что подтверждает способность лизостафина проникать в биопленку и оказывать бактерицидное действие на сесильные формы стафилококков.

Для борьбы с инфекциями, связанными с биопленками, в частности с развитием имплантат-ассоциированной инфекции, главным является не допустить адгезию бактерий на поверхность имплантата и окружающих его тканях, а также предупредить формирование микробных биопленок. В свою очередь, наличие новых эффективных действующих веществ для ингибирования и диспергирования биопленок будет способствовать выбору адекватных терапевтических стратегий для борьбы с конкретными инфекциями.

Заключение

Выполненное экспериментальное исследование демонстрирует высокую антистафилококковую активность фермента лизостафина в отношении клинических штаммов, выделенных от пациентов ортопедического профиля. Протестированная эндопептидаза характеризуется отсутствием избирательного действия на штаммы с различной чувствительностью к антибактериальным препаратам, однако установлены различия в видовой восприимчивости к лизостафину у стафилококков. Так, МИК фермента были ниже против клинических культур S. aureus. Бактерицидная активность лизостафина на клетки стафилококков в составе сформированной биопленки, характеризующихся сниженными метаболическими процессами, а также способность разрушать компоненты матрикса указывают на необходимость дальнейших исследований данного соединения с целью потенциального и перспективного использования лизостафина в качестве активного действующего вещества для профилактики развития стафилококковых инфекций, а также для лечения уже существующих хронических инфекций, связанных с имплантатами в ортопедии, кардиологии и стоматологии.