Вальпроевая кислота и целекоксиб усиливают влияние темозоломида на клетки глиобластомы

Глиобластома – агрессивная первичная опухоль головного мозга человека. Современный протокол комплексного лечения впервые выявленной глиобластомы включает хирургическую операцию, лучевую терапию и цитотоксический препарат темозоломид (ТМЗ), в дозе 75 мг/м² [1]. Эффективность лечения низкая: несмотря на все усилия врачей, опухоль рецидивирует через 4–8 мес. после удаления [2]. Реоперация и последующая химиотерапия может продлить жизнь пациента [3]. Используется 6–8 циклов ТМЗ с увеличением дозы до 150–200 мг/м² и далее до 400 мг/м². Прогноз неблагоприятный. Медиана выживаемости пациентов – 15 мес. [4].

Усиление антиглиомного действия химиотерапии – одно из главных направлений борьбы за жизнь пациента [5]. Клетки рецидивирующей глиобластомы характеризуются снижением степени метилирования ДНК [6] и активацией сигнального пути Wnt/β-катенина, что сопровождается ростом резистентности к ТМЗ. Определенные перспективы для воздействия на эти механизмы имеет комбинация вальпроевой кислоты (VPA) и целекоксиба (CXB).

VPA используется в неврологической практике как противосудорожное средство; противоопухолевое действие препарата связано с ингибированием деацетилаз гистонов, подавлением экспрессии генов slc12a2, slc12a5, slc15a8, fancd2 и rad51 [7], активацией проапоптотических белков TP53-PUMA, окислительно-восстановительным дисбалансом, блокадой жизненного цикла и усилением процессов метилирования ДНК в опухолевых клетках [8]. В свою очередь, CXВ – нестероидное противовоспалительное средство, которое подавляет циклооксигеназу 2 и через сигнальную ось PI3K/Act/ реактивирует GSK-3β, что уменьшает уровень β-катенина и подавляет механизмы симметричного деления, де-стабилизирует энергетический метаболизм, усиливает аутофагию и ухудшает процессы адаптации опухолевых клеток [9].

Цель работы: ретроспективно оценить выживаемость пациентов с рецидивирующей глиобластомой, получавших вальпроевую кислоту, и изучить ее влияние в комбинации с ТМЗ и целекоксибом на опухолевые клетки.

Материалы и методы

Пациенты. Материалом для открытого ретроспективного исследования послужили данные историй болезни 66 пациентов (31 мужчина и 35 женщин), получавших лечение в медицинском комплексе ДВФУ по поводу глиобластомы (МКБ10 – C71) с 2015 по 2020 г. Исследование одобрено Этическим комитетом ДВФУ (протокол № 7 от 08.06.2023 г.).

Опухолевые клетки. В работе использованы стандартные линии клеток глиобластомы: U-87 MG (HTB-14™), T98G (CRL-1690™) и инвазивной злокачественной глиомы С6 (CCL-107™), полученные от производителя, компании ATCC (American Type Cell Collection, US). Характеристики опухолевых клеток (ОК) соответствовали паспортным параметрам и подтверждались сертификатами соответствия ISO 9001, ISO 13485, ISO/IEC 17025 и ISO 17034. Все клеточные линии перед использованием протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30-1012K™).

Лекарственные субстанции: темозоломид (T2577), вальпроевая кислота (PHR2614), целекоксиб (169590-42-5) производства компании Sigma Aldrich.

Реагенты для культивирования опухолевых клеток. Культуральная среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium – DMEM, кат. № 21068028); антибиотик-антимикотик 100X: 10000 уд.ед./мл пенициллин/стрептомицин, 25 мкг/мл фунгизона (кат. № 15240096); эмбриональная телячья сыворотка (FBS кат. № 16000044); Трипсин, модифицированный ЭДТА (0,25% кат. № 25200056). Реагенты производства компании Gibco (США).

Экспериментальные животные. В работе использовано 75 крыс породы Вистар, массой 200–250 г. Содержание и уход за животными осуществляли в соответствии с требованиями законодательства РФ. Эксперимент in vivo одобрен Локальным этическим комитетом ДВФУ (протокол № 8 от 08.06.2023 г.).

Метод ретроспективного анализа. Возраст и пол пациентов, локализация опухоли, наличие в анамнезе хирургического лечения, химиолучевой терапии (ХЛТ), прием VPA и CXВ были основными параметрами анализа. Особое внимание уделялось выживаемости пациентов, сбор данных о пациентах проводился с соблюдением требований медицинской этики и деонтологии.

Метод культивирования опухолевых клеток. Опухолевые клетки культивировали в среде DMEM, с добавлением 10% FBS, 100 уд. ед/мл антибиотика-антимикотика 100X при стандартных условиях 37 ºC и 5% CO₂ до достижения 80% конфлюэнтности монослоя. Адгезировавшие клетки снимали с помощью ферментативной диссоциации (0,05% trypsin-EDTA, 1 : 4 в стандартных условиях, 5 мин.) и центрифугировали (120 g, 3 мин.), сливали надосадочную жидкость, добавляли свежую среду, ресуспендировали и после 3-го пассажа использовали в эксперименте.

Фармакологическое тестирование in vitro. Опухолевые клетки в количестве 3 × 10⁴ высевали в 24-луночные планшеты, культивировали 24 ч, затем среду меняли на новую, добавляли тестируемые субстанции в концентрациях полумаксимального ингибирования и культивировали 48 ч. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста согласно протоколу производителя. Необработанные клетки использовали в качестве контроля.

Моделирование глиомы in vivo. Животных наркотизировали путем в/б введения смеси (содержащей 200 мкл Золетил/Рометар 1:4); 0,5 × 10⁶ опухолевых клеток линии С6 имплантировали в мозг с помощью стереотаксического аппарата (Narishige, Токио, Япония) в соответствии с координатами: Ар-1; Л 3,0; V 4,5, ТБС-2,4 мм. Опухолевые клетки вводили шприцем Hamilton со скоростью 5 мкл/мин. Опухоль подтверждали через 10 дней с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Метод нейровизуализационного исследования. МРТ проводили на МР-томографе «Bruker's PharmaScan®» (Массачусетс, США) под общим наркозом с применением специальной магнитной катушки для мелких лабораторных животных.

Метод экспериментальной терапии in vivo. Для проведения исследования сформировано 5 групп (n = 15). Животных контрольной группы (группа I) оставляли без лечения. Крыс группы ХЛТ (группа II) облучали в дозе 20 Гр с помощью установки TrueBeam (Varian Medical Systems, США). ТМЗ давали перорально исходя из дозы 30 мг/кг с 1-го по 6-й день эксперимента. Животным группы VPA (группа III) и CXB (группа VI) проводили лучевую и химиотерапию согласно описанному выше протоколу, VPA вводили в/б в дозе 300 мг/кг; CXB давали перорально исходя из расчета 30 мг/кг. Крысам группы VPA + CXB (группа VI) в дополнение к химиолучевой терапии вводили оба препарат одновременно.

Статистическая обработка. Полученные данные подвергали обработке с использованием пакета Graph Pad Prism 4.00. Результаты представлены на графиках «ящик с усами»: отражены медианы, нижние и верхние квартили, минимальное и максимальное значения. Для выявления различий между группами и комбинациями веществ на различных опухолевых линиях проводили дисперсионный анализ. Попарные сравнения проводились t-критерием Стьюдента. Для сравнения медиан групп IC₅₀ был использован критерий Краскела – Уоллиса. Различия считали достоверными при p < 0,05. Анализ выживаемости проводили по методу Каплана – Майера.

Результаты исследования

Ретроспективное клиническое исследование

Согласно данным ретроспективного анализа, средний возраст пациентов на момент нахождения в стационаре составил 55 ± 11,6 года. У 97 % пациентов отмечена супратенториальная локализация опухоли (рис. 1А), которая чаще поражала правую гемисферу (рис. 1Б), причем в более 40% случаев распространялась на две и более доли мозга (МКБ10 – C71.8) (рис. 1В).

Ретроспективный анализ выполнен в три этапа (рис. 1Г). На первом из выборки были исключены 39 пациентов с глиобластомой, которые были прооперированы впервые. На втором этапе из выборки были исключены 9 пациентов, в силу различных причин не получавших лучевой и последующей терапии ТМЗ. На третьем этапе анализа выборка составила 18 человек, госпитализированных для реоперации по поводу рецидива опухоли: в их числе выявлено 11 пациентов, систематически принимавших VPА в дозе до 1000 мг в сутки, остальные 7 пациентов не принимали VPA и составили контрольную группу. Медиана выживаемости пациентов с глиобластомой, принимавших VPA, составила 22 мес; у пациентов контрольной группы, не получавших VPA, – 13 мес (рис. 1Д).

Экспериментальное исследование in vitro

Концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) VPA для клеток глиобластомы линий U87MG и T98G составила 1510 и 3900 μM; для линии С6 – 3600 μM (рис. 2А). IC₅₀ CXB для линий U87MG и T98G составила 30,1 и 41,07 μM, для опухолевых клеток линии С6 – 48,4 μM (рис. 2Б). ТМЗ в концентрации 844 μM вызывал гибель половины популяции опухолевых клеток линии U87MG. В отношении опухолевых клеток линии C6 и T98G показатель IC₅₀ составил 541,2 и 435,3 μM (рис. 2В). VPA достоверно усиливала антиглиомный эффект ТМЗ в отношении опухолевых клеток лини U87 (рис. 2Г), наибольшей восприимчивостью к действию комбинации CXB c ТМЗ обладали опухолевые клетки линии С6 и T98G. Комбинированное применение VPA и CXB с ТМЗ оказывало достоверное антиглиомное действие, выраженное в отношении всех протестированных линий.

Экспериментальное исследование in vivo

Для создания модели глиобластомы in vitro использована методика имплантации опухолевых клеток глиомы С6 в мозг иммунокомпетентных крыс породы Вистар. Опухоль, воспроизведенная в эксперименте, характеризуется инфильтративным ростом, ангиогенезом и формированием неопластического узла с центральным некрозом, хорошо визуализируемыми при МРТ на 14-й день наблюдений. К 28-му дню эксперимента размер опухолевого узла существенно различался у животных различных групп (рис. 3А). Химиотерапия ТМЗ в сочетании с лучевой терапией в суммарной дозе 20 Гр сопровождалась достоверным циторедукционным эффектом. В группе I к 28-му дню наблюдений опухоль занимала большую часть полушария мозга, что сопровождалось сдавлением, отеком и дислокацией срединных структур мозга, средний размер опухоли составил 233,13 ± 17,11 мм³, в группе II размер опухоли был 123,67 ± 8,8 мм³, что достоверно (р < 0,05) меньше, чем в контроле. Добавление в схему лечения VPA и CXB приводило к уменьшению объема опухоли, а комбинация данных лекарственных средств сопровождалась увеличением выживаемости экспериментальных животных, что подтверждает результаты клинических наблюдений. У крыс группы III и IV размер опухолевого узла достоверно отличался от животных из группы II и составил 82,23 ± 6,7мм³ и 85,13 ± 5,3мм³ соответственно. В группе V размер опухоли составил 60,1 ± 4,1 мм³. Медиана выживаемости экспериментальных животных группы I составила 24,5 дней, группы II – 44 дня, а группы III и IV составила 55 и 58 дней, в группе V – 65 дней (рис. 3Б).

Обсуждение полученных результатов

Средний возраст пациентов с глиобластомой, задействованных в нашем исследовании, соответствует данным мировой статистики: в большинстве случаев опухоль выявлялась во второй половине жизни одинаково часто как у женщин, так и у мужчин. Хирургическая операция и химиолучевая терапия были и остаются безальтернативными методами лечения глиобластомы, способными обеспечить значимый выигрыш в продолжительности жизни [10].

Отказ хотя бы от одного из компонентов этой программы ограничивает возможности пациентов. В связи с этим для участия в исследовании нами были отобраны только 18 пациентов, получивших полный курс лечения по протоколу Роджера Ступпа и госпитализированных с рецидивом для реоперации, из которых 11 человек получали VPA по поводу судорожных припадков.

Результаты исследования позволяют утверждать, что комбинация VPA с ТМЗ увеличивает выживаемость пациентов, реоперированных по поводу рецидива глиобластомы (p = 0,044). Медиана общей выживаемости пациентов, получавших VPA в нашем исследовании, – 22 месяца, что объективно больше, чем у контрольных пациентов. Безусловно, наше исследование выполнено на небольшом контингенте пациентов, однако оно позволяет уточнить и дополнить данные Peng-Yi Lee, связавшего прием противосудорожных средств после адъювантной химиотерапии с более благоприятным прогнозом [11]. Наши данные не противоречат сообщениям Deepthi Valiyaveettil [12] о большей медиане общей выживаемости пациентов с глиобластомой, получивших полный курс химиолучевого лечения в комбинации с VPA. Увеличение общей выживаемости при комбинации лучевой терапии и ТМЗ с VPA описано Shinichi Watanabe [13], что дополнительно подтверждается результатами эксперимента in vitro и in vivo.

Как следует из эксперимента, VPA достоверно усиливала антиглиомный эффект ТМЗ в отношении опухолевых клеток лини U87, однако важнейшей особенностью нашего исследования стала комбинация VPA c CXB, ранее показавшая антиглиомный эффект в сочетании c Wnt-ингибирующей активностью [9]. Прием CXB с первого дня химиолучевой терапии является вмешательством с низким риском и разумным основанием, что особенно актуально в силу сообщений о способности VPA активировать Wnt-сигналинг в клетках глиобластомы [14].

В эксперименте in vitro клетки линии C6 обладали довольно высокой чувствительностью к ТМЗ (рис. 2В). Линия С6 полностью воспроизводит патофизиологические механизмы опухолевого процесса в организме иммунокомпетентных животных [15]. Подобная динамика была характерна и для клеток глиобластомы человека. Конечно, клетки глиобластомы линии U87 обладали более низкой чувствительностью к ТМЗ, однако его цитостатическое действие возрастало в комбинации VPA, что указывает на большую значимость процессов ацетилирования гистонов в регуляции их жизненных процессов [16][17].

Вероятно, наблюдаемое нами усиление цитотоксического действия ТМЗ в отношении опухолевых клеток линии С6 и T98G в комбинации с CXB объясняется высоким содержанием в данных культурах опухолевых стволовых клеток. Особо заслуживает внимания тот факт, что все протестированные линии хорошо откликалась на комбинацию VPA и CXB, что, вероятно, может указывать на существенное расширение антиглиомных возможностей такой комбинации в отношении низкодифференцированных опухолевых клеток.

Выводы

VPA увеличивает выживаемость пациентов с глио-бластомой и в комбинации с CXB усиливает противоопухолевое действие ТМЗ в эксперименте in vitro и in vivo. Высокий антиглиомный потенциал комбинации VPA и CXB с ТМЗ открывает перспективы ее использования для оптимизации существующих подходов к лечению рецидива глиобластомы.