Метаболически ориентированное действие фукоидана из бурой водоросли Sargassum feldmannii на формирование колоний клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231

Процесс жизнедеятельности клетки – это сложный комплекс изменений во множестве биохимических реакций. После обнаружения в начале XX века Варбургом факта, что опухолевые клетки используют гликолиз для получения энергии, была надежда, что рак – нарушение гликолитического клеточного метаболизма [1]. Позднее, после открытия структуры и функций молекулярных носителей генетической информации (ДНК и РНК), было показано, что первопричиной рака являются мутации и перестройки генома. Были описаны сигнальные пути, определяющие клеточный рост, злокачественные трансформации и т. д.

Митоген-активируемый протеинкиназный (MAPK) каскад является одним из наиболее важных сигнальных механизмов, который активируется промоторами опухоли и участвует в клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе [2]. Каскад MAPK включает внеклеточные сигнально-регулируемые протеинкиназы (ERK), c-Jun N-концевые киназы/стресс-активируемые протеинкиназы (JNKs/SAPKs) и р38 киназы. Известно, что индуцирующие рост опухолевые промоторы, такие как 12-O-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (TPA), эпидермальный фактор роста (EGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF), могут эффективно индуцировать фосфорилирование ERKs киназ. С другой стороны, связанные со стрессом опухолевые промоторы, например ионизирующее и УФ-излучение, значительно активируют JNKs/SAPKs и p38 киназы. Однако позже было показано, что большинство ключевых процессов, протекающих в опухоли, оказывают влияние на метаболизм клеток и, в свою очередь, эти процессы находятся под влиянием метаболизма. Поэтому нарушение регуляции энергетики клеток (deregulating cellular energetics) было определено как один из ключевых признаков (hallmarks) рака [3]. При использовании вместе ингибиторов/активаторов сигнальных молекул и модуляторов клеточного метаболизма появляются новые возможности для предупреждения возникновения и лечения онкологических заболеваний. На сегодня используются две терапевтические стратегии, направленные на эффект Варбурга в раковых клетках. Одна из них предполагает прямое ингибирование гликолиза посредством влияния на активность гликолитических ферментов, а вторая – непрямое ингибирование гликолиза через влияние на сигнальные пути, регулирующие этот процесс [4]. Известно, что полисахариды бурых водорослей участвуют в процессах модуляции функциональных онкобелков и белков-супрессоров, регуляции путей клеточной сигнальной трансдукции (MAPK, PI3K/AKT/mTOR), контроле неопластической трансформации клеток, индукции апоптоза и др. [5-8]. Низкая токсичность для организма, оригинальность структур и разнообразная биологическая активность полисахаридов бурых водорослей открывают широкие возможности для исследования метаболически ориентированного действия с целью подавления процессов канцерогенеза. Исследование таких природных соединений, как фукоиданы бурых водорослей, в качестве модуляторов метаболизма представляется перспективной стратегией для повышения эффективности противоопухолевой терапии.

Материалы и методы

Реагенты и материалы: DEAE – MacroPrep (Sigma); органические растворители, неорганические кислоты и соли – коммерческие препараты фирмы «Диаэм» (Россия); в работе использовали клетки меланомы SK-MEL-28 (АТСС #HTB-72), карциномы двенадцатиперстной кишки HuTu80 (АТСС #HTB-40) и рака молочной железы человека MDA-MB-231 (АТСС #HTB-26). Наборы «Glucose Uptake Colorimetric Assay Kit» (Sigma Aldrich); «Lactat-Glo^TM Assay» и «Glutamate-Glo^TM Assay» (Promega).

Культивирование клеток: клетки SK-MEL-28, HuTu80 и MDA-MB-231 культивировали в соответствии с протоколом по культивированию этих клеток с добавлением пенициллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л) в инкубаторе MCO-18AIC, SANYO (Япония) при температуре 37 °С, содержание СО₂ – 5%.

Фукоидан SfF2 был выделен из бурой водоросли Sargassum feldmannii, как описано ранее [9], SfF2 является сульфатированным (25,3%) галактофуканом (Fuc/Gal = 72/28 mol%). SfF2 построен из 1,3-связанных остатков α-L-Fucp и β-D-Galp с остатками фукозы по положениям С4 и С6 остатков галактозы и С2 остатков фукозы.

Облучение клеток. MDA-MB-231 клетки (5 × 10⁵) рассеивали на чашки Петри (60 мм) и культивировали в 5 мл соответствующей питательной среды при температуре 37 °С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Затем клеточные культуры облучали рентгеновским излучением (X-ray) в дозе 1 Гр при комнатной температуре с использованием разовых доз, рентгеновской системой XPERT 80 (Milford, США) и помещали в СО₂-инкубатор на 3 часа. После клетки использовали для определения действия фукоидана на захват глюкозы; формирование и рост колоний раковых клеток.

Метод мягких агаров. Клетки MDA-MB-231 (8 × 10³ клеток) обрабатывали 2ДГ (1 мМ), EGF (10  нг/мл), TPA (10 нг/мл), X-Ray (1Гр) и фукоиданом SfF2 (200 мкг/мл) индивидуально или в сочетании (в соответствии с условиями эксперимента). Затем клетки помещали в BME агар (0,3%), содержащий 10% FBS, 2 мМ глутамина и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки культивировали при 37 °С (5% СО₂) в течение 14 дней. Колонии клеток оценивали с использованием обратимого микроскопа Motic AE 20 (Китай) и программы Motic Image Plus.

Статистическая обработка данных проведена с использованием t-критерия Стьюдента в условиях заданной доверительной вероятности, равной 95% (программа SigmaPlot 2000, вер. 6, SPSS Inc., США).

Результаты исследования

На первом этапе данного исследования был идентифицирован предпочтительный метаболический путь, используемый клетками меланомы SK-MEL-28, рака молочной железы MDA-MB-231 и карциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu80. Определены оптимальные концентрации (SK-MEL-28 – 2,0×10⁴/мл; MDA-MB-231 – 3,0 × 104/мл и HuTu80 – 5,0 × 10⁴/мл) и время культивирования исследуемых клеток – 48 часов. Установлено, что клетки SK-MEL-28 способны поглощать 172 пмоль 2ДГ, клетки MDA-MB-231 – 96 пмоль, а клетки HuTu80 поглощают всего 17 пмоль 2ДГ (табл. 1) при одинаковых экспериментальных условиях. Вероятно, для клеток HuTu80 доля энергии, получаемой от аэробного гликолиза, невелика, и предпочтительным метаболическим путём получения энергии является митохондриальное окислительное фосфорилирование. Установлено, что клеткам меланомы SK-MEL-28 и рака молочной железы MDA-MB-231 свойственен повышенный захват глюкозы и высокая скорость аэробного гликолиза, что характерно для клеток с гликолитическим биоэнергетическим фенотипом.

Затем было определено содержание лактата (в образцах клеточных лизатов и образцах питательной среды клеток), конечного продукта гликолиза и глутамата (в образцах клеточных лизатов), накапливающегося в клетках при образовании энергии путем окислительного фосфорилирования.

Показано, что содержание лактата в среде культивирования клеток меланомы SK-MEL-28 достигало 14 × 10⁶ пмоль через 24 ч и 22 × 106 пмоль через 48 ч, в то же время содержание глутамата в образцах клеточных лизатов данного типа клеток составляло 3,6 × 10⁶ пмоль через 24 ч и 4,0 × 10⁶ через 48 ч (рис. 1А). Содержание лактата в питательной среде клеток HuTu80 составляло 2,7 × 10⁶ пмоль через 24 ч и 3,0 × 10⁶ пмоль через 48 ч. Содержание глутамата в образцах клеточных лизатов HuTu80 составляло 8,5 ×  10⁶ пмоль через 24 ч и 13,6 × 10⁶ через 48 ч (рис. 1Б). Содержание лактата в питательной среде клеток MDA-MB-231 составляло 3,1 × 10⁶ и 4,9 × 10⁶ пмоль через 24 и 48 ч соответственно. Содержание глутамата в образцах клеточных лизатов MDA-MB-231составляло 2,4 × 10⁶ пмоль через 24 ч и 3,5 × 10⁶ через 48 ч (рис. 1В).

Эти результаты согласуются с данными, полученными в ходе определения количества поглощенной глюкозы: для клеток меланомы SK-MEL-28 и клеток рака молочной железы MDA-MB-231 предпочтительным является метаболический путь гликолиза, а для клеток рака двенадцатиперстной кишки HuTu80 – путь окислительного фосфорилирования (табл. 1).

Известно, что клетки трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ), к которым относятся клетки MDA-MB-231, обладают способностью перепрограммировать свой метаболизм при использовании некоторых ингибиторов метаболизма [10].

С целью определения биоэнергетического потенциала клеток под воздействием различных факторов, стимулирующих прогрессирование опухолей в клетках MDA-MB-231, представляло интерес исследовать действие инсулина, эпидермального фактора роста (EGF), форболового эфира (TPA) и рентгеновского излучения (X-ray). Показано, что инсулин в значительной степени ускоряет процесс захвата 2-дезокси-глюкозы (2ДГ) MDA-MB-231 клетками на 19% соответственно по сравнению с базовым потреблением 2ДГ без инсулина. EGF не стимулировал MDA-MB-231 клетки на захват 2ДГ, что, вероятно, связано с отсутствием экспрессии ER, PR, HER2-рецепторов в данном типе клеток (трижды негативный) и соответственно с отсутствием пролиферативного ответа клеток на EGF. Обработка клеток форболовым эфиром тоже не приводила к увеличению захвата 2-дезокси-D-глюкозы. Следует отметить, что под действием рентгеновского облучения захват 2ДГ увеличивался почти в 2 раза (165 пмоль) по сравнению с контрольными клетками (89 пмоль).

Имеются данные о снижении уровня экспрессии переносчика глюкозы 1 (GLUT1) в клетках MDA-MB-231, которые относятся к ТНРМЖ, после их обработки фукоиданом [11]. Определена способность фукоидана SfF2 оказывать прямое ингибирующее действие на процесс поглощения 2ДГ, стимулированный различными канцерогенными факторами (табл. 2). Установлено, что SfF2 в концентрации 200 мкг/мл ингибирует захват 2ДГ, стимулированный инсулином, EGF, TPA, X-ray в MDA-MB-231 на 61, 81, 37 и 82% соответственно по сравнению с клетками, обработанными только канцерогенными факторами (табл. 2).

Определено метаболически ориентированное действие фукоидана SfF2 из S. feldmannii (200 мкг/мл) на процесс формирования колоний клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 при нормальных условиях (рис. 2) и под воздействием различных канцерогенных факторов (рис. 3). Показано, что ингибитор гликолиза 2ДГ (1 мМ) снижает количество колоний MDA-MB-231 клеток на 12% по сравнению с контрольными необработанными клетками (рис. 2А). Фукоидан SfF2 в концентрации 200 мкг/мл усиливает ингибирующее действие 2ДГ и уменьшает количество колоний MDA-MB-231 клеток на 23% по сравнению с контролем соответственно (рис. 2А).

Известно, что инсулин стимулирует аэробный гликолиз опухолевых клеток, индуцируя их пролиферацию. Представляло интерес исследовать влияние инсулина на формирование и рост колоний MDA-MB-321 клеток и способность фукоидана ингибировать данный процесс. Обработка MDA-MB-231 клеток 2ДГ (1 мМ) и инсулином (1 мкМ) индуцировала рост колоний исследуемых клеток на 11% по сравнению с клетками, обработанными 2ДГ (рис. 2Б). Определено, что фукоидан ингибировал инсулин-индуцированное формирование колоний MDA-MB-231 клеток на 51% по сравнению с клетками, обработанными инсулином и 2ДГ (рис. 2Б).

Известно, что такие канцерогенные факторы, как эпидермальный фактор роста (EGF), форболовый эфир (TPA) и ионизирующее излучение (X-ray) способствуют прогрессированию опухолей посредством воздействия на различные молекулярные мишени и запуска сигнальных каскадов, которые играют важную роль в развитии рака. В литературе имеются данные о том, что EGF и TPA стимулируют активность внутриклеточных тирозинкиназ. Белки тирозинкиназы, в свою очередь, передают сигнал внутри клетки, что приводит к различным биохимическим изменениям: повышение концентрации внутриклеточного кальция и усиление гликолиза, увеличение скорости синтеза белка, синтез ДНК, что в конечном счете приводит к усиленному делению клетки [12]. В настоящей работе определено, что EGF (10 нг/мл) или TPA (10 нг/мл) в сочетании с 2ДГ (1мМ) в значительной степени индуцируют образование колоний MDA-MB-231 клеток (рис. 3А, Б). Количество колоний исследуемых клеток увеличивается на 33 и 27% под воздействием 2ДГ с EGF (рис. 3А) или 2ДГ с TPA (рис. 3Б) соответственно по сравнению с клетками, обработанными только EGF или TPA. Фукоидан SfF2 в концентраци 200 мкг/мл эффективно подавляет EGF-индуцированное формирование колоний MDA-MB-231 клеток на 59% (рис. 3А) и TPA-индуцированное формирование колоний – на 66% (рис. 3Б) соответственно по сравнению с клетками, обработанными 2ДГ с EGF или 2ДГ с TPA.

Установлено, что обработка MDA-MB-231 клеток низкой дозой рентгеновского облучения X-ray (1 Гр) в сочетании с 2ДГ приводит к увеличению числа колоний тестируемых опухолевых клеток на 13% по сравнению с клетками, обработанными только X-ray (рис. 3В). Показано, что фукоидан SfF2 способен предотвращать X-ray-индуцированное формирование и рост колоний MDA-MB-231 клеток на 36% по сравнению с клетками, обработанными X-ray (1 Гр) с 2ДГ (рис. 3В).

Обсуждение полученных данных

Разработка новых стратегий лечения онкологических заболеваний является актуальной задачей. Раковые клетки, для которых характерен аэробный гликолиз, предпочитают поглощение глюкозы и продукцию лактата даже в присутствии кислорода (эффект Варбурга), тогда как глутамин чрезвычайно важен для окислительного фосфорилирования и окислительно-восстановительной регуляции. Доказано, что сульфатированные полисахариды бурых водорослей, фукоиданы проявляют антипролиферативное, антимиграционное, антиметастатическое и метаболическиориентированное действие в отношении раковых клеток человека и могут быть использованы для повышения эффективности терапии рака [13].

В настоящей работе мы подтвердили, что клетки меланомы SK-MEL-28, рака молочной железы MDA-MB-231 и карциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu80 поглощают глюкозу и выделяют лактат с различной скоростью. Известно, что клетки трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ), к которым относятся клетки MDA-MB-231, обладают способностью перепрограммировать свой метаболизм при использовании некоторых ингибиторов метаболизма. Мы впервые обнаружили, что фукоидан из S. feldmannii может снижать поглощение 2-дезокси-глюкозы (2ДГ), стимулированное различными канцерогенными факторами, в клетках MDA-MB-231. Ранее было исследовано влияние фукоиданов из бурых водорослей на поглощение глюкозы с целью оценки их антидиабетического потенциала. Было продемонстрировано, что обработка нормальных адипоцитов 3T3 фукоиданом из бурой водоросли Undaria pinnatifida стимулировала поглощение глюкозы и восстанавливала поглощение глюкозы инсулинорезистентными адипоцитами, индуцированными ожирением [14]. Shan и соавт. [15] указали на потенциальное влияние фукоидана из Ascophyllum nodosum на регуляцию уровня глюкозы в крови путем прямого ингибирования активности транспортера глюкозы SGLT1, что приводило к заметному снижению транспорта глюкозы и облегчению постпрандиальной гипергликемии.

2ДГ, аналог глюкозы, ингибирующий гликолиз, широко используется в качестве метаболического модификатора для нарушения/ингибирования/остановки пролиферации раковых клеток. Мы предположили, что фукоидан в сочетании с 2ДГ может усиливать ингибирующее действие 2ДГ на образование колоний клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, стимулированное различными канцерогенными факторами.

Заключение

Полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о том, что фукоидан из бурой водоросли S. feldmannii усиливает действие 2ДГ, вызывающее выраженное ингибирование образование колоний клеток MDA-MB-231. Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором показано, что фукоидан из бурой водоросли S. feldmannii обладает метаболически ориентированным потенциалом на модели формирования колоний клеток рака молочной железы человека.