Функциональная активность тучных клеток при экспериментальном тиреотоксикозе в клеточной культуре

Роль тучных клеток (мастоцитов, МС) в патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы изучена недостаточно [1][2]. Однако публикации по морфологии щитовидной железы (ЩЖ) и структуре ее тканей свидетельствуют о присутствии МС в ЩЖ в достаточно большом количестве межфолликулярно, паравазально и парафолликулярно [3][4]. Функция мастоцитов в ЩЖ точно неясна, вероятно, они могут участвовать в синтезе и/или хранении, рецепции тиреоидных гормонов, что может играть важную роль при аутоиммунной патологии ЩЖ [3][5][6]. С 2013 года нами был проведен ряд экспериментов с созданием моделей экзогенного гипотиреоза и тиреотоксикоза, в результате которых была впервые доказана возможность костимулирующей роли МС при изменении уровня тиреоидных гормонов, сопровождающаяся значимым повышением ряда цитокинов в крови и активной экспрессией МС в щитовидной железе CD86 [6]. Данные других авторов, опубликованные в 2022 г., продемонстрировали роль фактора Foxe1 в патогенезе аутоиммунной патологии щитовидной железы [7]. Foxe1 – тиреоспецифичный фактор транскрипции, влияющий на развитие ЩЖ, авторы указывают на его роль в поддержании дифференцировки щитовидной железы [7][8]. Foxe1 является транскрипционным активатором тиреоидной пероксидазы (TPO) и тиреоглобулина, опосредуя ответ тиреоцитов на внешние стимулы: тиреотропный гормон, инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1) и трансформирующий фактор роста-β [9]. В соответствии с более ранней работой, проведенной in vivo, было продемонстрировано, что Foxe1 необходим для экспрессии ТПО и тиреоглобулина в фолликулярных клетках щитовидной железы мышей [7]. Экспериментальная модель продемонстрировала, что делеция Foxe1 приводит к гипотиреозу, связанному с увеличением количества МС в ЩЖ, что возможно объясняет результаты и наших исследований, связывающих функцию тучных клеток с экзогенным тиреотоксикозом и гипотиреозом и/или аутоиммунным тиреоидитом [6]. Более того, в 2019 году было вновь высказано мнение, что МС могут хранить тиреоидный гормон трийодтиронин (Т3) и экспрессировать мембраносвязанные рецепторы ТТГ, это позволило авторам предположить, что функция ЩЖ может влиять на активацию МС, а их дегрануляция может влиять на функцию ЩЖ [5]. В унисон было высказано предположение, что связующим звеном между иммунной и эндокринной системами может выступать гистамин, синтезируемый МС [10][11].

С целью установления степени влияния тиреоидных гормонов на функциональную активность МС, было проведено культивирование тучных клеток (HMC-1 – human mast cells) в питательных средах, содержащих тироксин (Т4, гормон ЩЖ).

Материалы и методы

Данное исследование было одобрено Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 9 от 16.05.2022 г.). Использовали постоянную линию тучных клеток человека HMC-1 (Human mast cell, МС). Источник клеток – American Type Culture Collection (ATCC). Биомассу МС наращивали в среде Искова, модифицированной по Дульбекко (IMDM, Sigma-Aldrich) с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Himedia, Индия), смеси заменимых аминокислот MEM NEAA (Gibco), смеси незаменимых аминокислот MEM EAA (Sigma-Aldrich), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco). Затем тучные клетки рассаживали в 6-луночные планшеты и культивировали при 37 °C, 5% CO₂ и влажности 95% в среде № 1 – IMDM с описанными выше добавками и параллельно в среде № 2 – DMEM (модифицированная по Дульбекко среде Игла, Sigma-Aldrich) с добавками, аналогичными среде IMDM. Пробы со средами 1 и 2 без МС являлись контрольными. В среду № 1 и 2 с МС из второго планшета добавляли тироксин (гормон Т4, препарат «Ликватирол» 100 мкг/5 мл, Галеника Фармасьютикал Индастри) до конечной концентрации, соответствующей содержанию в сыворотке крови 54 нмоль/л. Содержание свободного Т4 проверялось дважды методом ИФА во всех пробах сред DMEM, IMDM исходно и с тироксином для подтверждения искомой концентрации (табл. 1, 2). В контроле уровень свободного Т4 был в пределах физиологических значений (табл. 1, 2). Исследование сред на содержание в них цитокинов и Т4 осуществлялось сразу после пересадки МС в следующий планшет. Ежедневное наблюдение за клетками осуществляли с помощью инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus, Япония), оснащенного системой фазового контраста. Съемку проводили камерой AxioCam5 (Carl Zeiss) с помощью лицензионного программного обеспечения Zen 2, Blue Edition (Carl Zeiss).

Жизнеспособность МС определяли с помощью флуоресцентных красителей с последующей проточной цитометрией перед пересадкой клеток на 3-и и 7‑е сутки. В 1, 3, 7‑е сутки тучные клетки собирали из лунок планшета, осаждали центрифугированием при 500g (об/мин) в течение 5 мин при комнатной температуре, к осадкам клеток из индивидуальных лунок добавляли 100 мкл смеси красителей на фосфатном буфере (Sigma-Aldrich): 4',6 диамидино-2-фенилиндол (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 1 мкг/мл для окрашивания мертвых клеток и H2DCFDA (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 10 мкг/мл для окрашивания клеток с функционально-активными митохондриями, TO-PRO-3™ (Thermo Scientific) в конечной концентрации 1 мкМ для окрашивания апоптотически измененных клеток. Окрашивание производили в течение 10 мин при комнатной температуре.

После этого суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman-Coulter), подключенном к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (v. 2.6, Beckman-Coulter). Для анализа жизнеспособности учитывали не менее 10 тысяч одиночных клеток в суспензии. Смену среды проводили на 3-и и 7‑е сутки, перед этим отбирали также пробы среды из-под культивированных МС на содержание цитокинов: INF-γ, TNF-α, IL-6 и гормона T4. Содержание цитокинов и гормонов проводили с помощью метода ИФА и метода иммунохемилюминесценции с использованием парамагнитных частиц на автоматическом анализаторе (Mindray CL-2000i, Китай; Unicel DxI 800, Beckman Coulter).

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.7.0 (разработчик – ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели, учитывая количество проб, не соответствовали нормальному распределению (критерий Колмогорова – Смирнова), поэтому все показатели были описаны с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3); 95% доверительные интервалы рассчитывались по методу Клоппера – Пирсона. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Сравнение двух групп по количественному показателю выполнялось с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Результаты исследования

Внешний вид культуры HMC-1 представлен на рисунке 1. Морфология клеток в среде без и с добавлением тироксина внешне не отличалась. Культура в средах с тироксином была склонна расти группами клеток (рис. 1 Г), нежели одиночными клетками (рис. 1 Б). Жизнеспособность клеток во время «посадки» в эксперимент и через 1 сутки культивирования составляла 93–95%, а концентрация была 12–15 млн. клеток/мл (рис. 2).

К 7-м суткам концентрация увеличивалась до 34–37 млн клеток/мл, жизнеспособность снижалась до 80–85%, вероятно, вследствие истощения питательных сред. Зависимости жизнеспособности, концентрации клеток от типа питательной среды и присутствия тироксина обнаружено не было.

В параллельно поставленных средах № 1 и 2 с МС содержание цитокинов динамически изменялось. Уровень TNF-α, IL-6, INF-γ возрастал в обеих группах МС с Т4 и без добавления Т4, начиная с 1-х и максимально к 7-м суткам эксперимента (табл. 1 и 2). Установлено отсутствие статистически значимого различия между показателями IL-6, INF-γ в средах с МС без добавления Т4 и с Т4, но наличие статистически достоверной разницы зафиксировано с контролем (табл. 1, 2). Более того, тироксин влиял и на агрегацию тучных клеток (рис. 1).

Нарастание уровней IFN-γ, TNF-α и IL-6 зафиксировано в серии проб обеих культуральных сред с МС, параллельно взятых после пересадки клеток на к 7-м суткам эксперимента (табл. 1, 2). При этом в средах с добавлением и без тироксина уровень IL-6 и IFN-γ нарастал к 7-м суткам по-разному (табл. 1, 2).

Так, если повышенный уровень IFN-γ в сравнении с исходными показателями в обеих сериях проб изменился несущественно (p > 0,05); то показатели IL-6 увеличились в средах без добавления Т4 в 5,5 раза, а в среде МС с добавлением Т4 – только лишь в 1,5 раза. При сравнении уровня TNF-α в среде МС без добавления Т4 с исходными показателями цитокин нарастал к 7-м суткам в 9 раз, а в среде с МС и тироксином TNF-α к 7-м суткам увеличился в 29 раз.

Обсуждение полученных данных

Адекватность подбора питательных сред и независимость показателей от типа среды подтвердилась отсутствием разницы между показателями IL-6, INF-γ, TNF-α и Т4 в двух средах ДМЕМ и IMDM на этапах подготовки сред. В средах с МС без добавления Т4 и с Т4 независимо от вида среды имели место существенные отличия от контроля по всем вышеназванным показателям, и логично заключить, что это определялось наличием в средах именно клеток МС, так как никаких других дополнительных факторов не применялось.

МС активно синтезировали de novo или продуцировали TNF-α в значительном количестве (табл. 1, 2). Резонно было бы предположить, что под воздействием высокого TNF-α высвобождался бы и IL-6 [7][11]. Так, если в 1‑е сутки эксперимента оба цитокина были выше контрольных показателей, а порядок их значений был сравним, то к 7-м суткам значения TNF-α уже превышали показатели IL-6 в 57 раз при стимуляции клеток Т4 и лишь в 4,4 раза – без стимуляции Т4.

Данные работы не только подтверждают продукцию МС цитокинов – IL-6 и IFN-γ, но и свидетельствуют, что IL-6 этими клетками вряд ли синтезируется de novo, так как уровень IL-6 не возрастал параллельно с нарастанием значений TNF-α, что могло бы иметь место в случае синтеза МС IL-6 при известной тесной взаимосвязи обоих цитокинов.

Тироксин продемонстрировал свое существенное (трехкратное) стимулирующее влияние на синтез/продукцию тучными клетками TNF-α de novo (табл. 1, 2). Репрезентативность экспериментальных данных при проведении культивирования на оригинальных клеточных линиях без взаимодействия с другими внешними факторами позволила предположить, что повышение содержания тироксина в среде МС может приводить к их активации и дополнительному синтезу цитокинов.

Учитывая результаты наших предшествующих клинических исследований аутоиммунного тиреотоксикоза и экспериментов на животных in vivo, когда МС в ЩЖ реагировали на изменение в крови концентрации Т4 повышенной секрецией INF-γ, IL-10 и гиперэкспрессией костимулирующих молекул CD86 в парафолликулярном пространстве ЩЖ [6][11], логично утверждать о возможном участии тучных клеток в аутоиммунных заболеваниях ЩЖ. Конечно, в эксперименте на животных значимое повышение других, кроме TNF-α, цитокинов можно объяснить наличием вокруг МС тиреоцитов и их тиреоглобулина, тирозина, ТПО, которые могут являться дополнительными антигенами для активации МС.

Вероятное развитие в дальнейшем аутоиммунной реакции в ЩЖ с синтезом тиреоидных аутоантител возможно только при наличии генетических факторов [1][3], определяющих индивидуальные особенности иммунологического реагирования и наличием активированных Т-хелперных лимфоцитов в ЩЖ [11]. Для уточнения этих механизмов необходима серия экспериментов c сокультивированием тиреоцитов и МС.

Заключение

Основываясь на представленных данных и учитывая, что репрезентативность эксперимента определялась оригинальностью постоянной линии тучных клеток человека HMC-1, функционирующей без воздействия внешних факторов, можно признать возможным, что тучные клетки реагируют дополнительным синтезом/продукцией TNF-α при изменении содержания тиреоидных гормонов в окружающей среде. Эти результаты позволяют предположить, что подобная реакция МС возможна in vivo. Для дополнительного подтверждения данной научной гипотезы необходима серия дополнительных экспериментов с культурами МС и тиреоцитов.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ЗВВ

Анализ и интерпретация данных – ЗВВ, БАВ, МЕВ

Окончательное утверждение для публикации рукописи – МЕВ, БАВ, ЗВВ

Сбор и обработка материала – БАВ, ЗВВ

Статистическая обработка – ЗВВ, БАВ

Написание текста – ЗВВ, БАВ