Виром мумии ископаемого волка (Canis lupus) как потенциальный источник вирулентных бактериофагов для фаготерапии

В настоящее время отмечается неуклонный рост числа исследований, посвященных оценке биологического разнообразия бактериофагов, что в значительной мере определяется возможностью использования данных вирусов в качестве лечебных и профилактических средств для борьбы с инфекциями, обусловленными мультирезистентными к антимикробным препаратам бактериями.

При изучении фаговых виромов в различных типах биологического материала активно применяются метагеномные методы исследования. Использование достижений метагеномики привело к парадоксальным результатам, которые позволили переосмыслить значение отдельных природных биомов в качестве источника бактериофагов. В частности, оказалось, что наиболее разнообразными по таксономическому и генетическому составу являются фаги экстремальных криогенных местообитаний, таких как арктические многолетнемерзлые почвы, водные экосистемы Арктики, Антарктики и ледники горных систем [1][2].

Кроме того, продемонстрировано [2], что микробиота, сохраняющаяся в реликтовых криогенных средах, представляет собой резервуар новых ранее не описанных таксонов бактериофагов.

В данной работе мы приводим результаты метагеномного анализа древнего микробного сообщества, ассоциированного с пищеварительным трактом ископаемого животного, законсервированного в многолетней мерзлоте на протяжении более чем 12 000-летнего периода. Целью проведенного анализа являлась оценка структуры вирома с точки зрения перспектив поиска новых вирулентных бактериофаговв биологическом материале данного типа.

Материал и методы

Методом шотган-метагеномного секвенирования изучен фаговый виром содержимого толстой кишки палеонтологического объекта «туматский щенок». Материал представляет собой мерзлую мумию щенка волка или собаки (Canis lupus), найденную экспедицией НИИПЭС СВФУ в местонахождении Сыалах (71°00'27.75" с. ш., 139°53'20.01" в. д.) расположенном в 45 км к северо-востоку от с. Тумат Усть-Янского улуса (района) Республики Саха (Якутия). Проведенное радиоуглеродное датирование данной мумии (12 460 ± 50 лет (GRA-52435)) позволяет предположить поздний неоплейстоценовый возраст находки [3].

Образцы содержимого толстой кишки получали в асептических условиях при некропсии мумии в лаборатории «Музей мамонта им. П.А. Лазарева» НИИ прикладной экологии Севера СВФУ им. М.К. Аммосова. Выделение ДНК из данного материала проводили с использованием DNeasy Powersoil Pro (Qiagen), при этом для получения 50 мкл ДНК концентрацией 32 нг/мкл из пробы объемом 2 г использовали 8 колонок.

Библиотеку фрагментов ДНК готовили с использованием набора реагентов Illumina Nextera XT DNA Sample Prep Kit (Illumina, США) согласно инструкции производителя. Качество полученной библиотеки оценивали с помощью анализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США). Ампликоны метили Nextera XT Index Kit (Illumina) согласно инструкции производителя.

Метагеномное секвенирование методом «дробовика» проводилось на приборе HiSeq 2500 Sequencing System/ Illumina в ресурсном центре «Биобанк» СПбГУ с использованием HiSeq 2500 Sequencing Kitсогласно инструктивной документации производителя.

Анализ качества прочтений секвенирования проводился с помощью программы FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc). Подготовка прочтений секвенирования проводилась спомощью программы Trimmomatic v.0.39 (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic). Сборка контигов de novo проводилась с использованием SPAdes v. 3.15.3 с опцией metaspade с последующим бинингом контигов в MaxBin 2.2.7 (https://sourceforge.net/projects/maxbin2). Контроль качества сборок проводили в QUAST v. 5.0.2 (https://cab.spbu.ru/software/quast/). Аннотация метагеномных образцов осуществлялась с помощью онлайн-сервисов CCMetagen 1.3 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/CCMetagen) и MG-RAST (www.mg-rast.org ).

Результаты исследования

В результате метагеномного секвенирования получено 7 682 400 прочтений (34 885 634 пар оснований), из которых было сформировано 11 894 контига средним размером 2933 пары нуклеотидов.

В структуре микробиома из числа прокариот существенным образом представлены ризосферные и почвенные микроорганизмы, в частности бактерии родов Pseudomonadaceae и Clostridiaceae (рис.). Данное обстоятельство, вероятно, объясняется возможностью заглатывания животным растений с частичками почвы при жизни или попаданием частиц грунта в пищеварительный тракт в процессе захоронения.

Установлено также, что последовательности ДНК бактериофагов семейства Myoviridae широко представлены в составе данного микробиома, составляя 1,48% от общего числа аннотированных последовательностей (рис.).

Из числа идентифицированных родов бактериофагов преобладают вирулентные хвостатые phiKZ-подобные фаги, которые составляют 1,4% (111 последовательностей) в структуре всех последовательностей, соответствующих родам микроорганизмов.

Следует отметить обилие последовательностей бактериофагов семейств Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae неясного таксономического статуса.

Обсуждение полученных данных

В структуре вирома мерзлой мумии щенка волка преобладают хвостатые бактериофаги семейства Myoviridae. Эти данные соответствуют результатам ранее проведенных исследований, указывающих на изобилие фаговых последовательностей в арктических микробиомах [1].

PhiKZ-подобные бактериофаги, последовательности которых были выявлены в ходе нашего исследования, относятся к нетаксономической группе так называемых «джамбо-фагов» (jumbo phages). Общей чертой данных бактериофагов, описанных у псевдомонад [4], является наличие крупного генома, способность к образованию «псевдоядер» в цитоплазме бактериальной клетки и наличие мощной неспецифической защиты от бактериальных систем CRISPR/Cas, что делает эти вирусы перспективными для практического использования в составе терапевтических бактериофаговых препаратов [5][6].

Перспективы дальнейших исследований связаны с поиском интактных бактериофагов, прежде всего псевдомонадных, в образцах палеонтологического материала и определением их биологических свойств, а также круга хозяев. Следует отметить, что в настоящее время считается доказанным факт, что крупные ДНК-содержащие вирусы могут сохранять контагиозность при консервации в многолетнемерзлых породах на протяжении десятков тысяч лет [7][8].

Заключение

Результаты метагеномного анализа микробиома «туматского щенка», описанные в настоящем исследовании, свидетельствуют о возможности использования палеонтологического материала, сохраняющегося в древней мерзлоте Арктики, в качестве ресурса для поиска и выделения новых бактериофагов, имеющих перспективы применения в качестве антибактериальных агентов или объектов биотехнологии.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: научное исследование (публикация статьи) выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ № 20-29-01043 («Древняя ДНК»).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – АЕГ

Сбор и обработка материала – МЮЧ, СЕФ, ЯАА, ДВА, ВВК, АПС

Написание текста – АЕГ

Редактирование – ЯАА