Анализ устойчивости бактерий рода Enterococcus к антибиотикам

Микроорганизмы рода Enterococcus – представители типичной кишечной микрофлоры млекопитающих, причина многих заболеваний человека и животных: эндокардиты, маститы, метриты, сепсис новорожденных и др. [1]. Патогенность представителей рода Enterococcus неотъемлема от их чувствительности к антибиотикам и связана с наличием детерминант патогенности в одних и тех же носителях генетической информации [2]. Самыми распространенными видами рода Enterococcus являются E. faecalis и E. faecium, среди которых чаще всего встречается такой вид, как E. faecalis. Однако в зависимости от различных экологических условий биотопов возможны разные соотношения этих микроорганизмов в микробиоценозе, кроме того, может отмечаться и наличие других видов рода Enterococcus. E. faecalis считается более патогенным по сравнению с E. faecium, однако последний имеет большую устойчивость к антибиотикам [3].

На данный момент антибиотикорезистентность энтерококков, выделенных от животных, является серьезной проблемой, поскольку неправильное использование антибактериальных препаратов, а также применение в сельском хозяйстве ампициллина и гентамицина в качестве пищевых добавок для стимуляции роста создают условия для формирования в организме животных резистентных к антибиотикам штаммов энтерококков [4]. Доказано, что антибиотикорезистентные представители рода Enterococcus могут передаваться от зараженных животных к человеку из-за тесного контакта или при употреблении в пищу продуктов животного происхождения [5].

Виды энтерококков, включая наиболее клинически важных представителей этого рода, Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, являются нормальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта человека и поэтому повсеместно встречаются в бытовых сточных водах. Сточные воды могут загрязнять поверхностные и грунтовые воды многими путями, включая неадекватную очистку сточных вод, разливы из-за неисправности или перегрузки инфраструктуры, а также удаления отходов животноводства на сушу или в водные объекты, обеспечивая попадание в организм людей путем заглатывания воды или при бытовых контактах с загрязненной водой [3]. В соответствии с нормативными документами необходимо уделить особое внимание к определению чувствительности к антибиотикам для групп микроорганизмов с высокой частотой распространения и приобретенной устойчивостью [6]. В связи с этим целью данного исследования являлось изучить устойчивость штаммов рода Enterococcus к антибиотикам и дезинфектантам, выделенных на территории водных объектов г. Владивостока.

Материалы и методы

Из образцов воды (из р. Вторая Речка в период 17 января 2018 по 27 сентября 2020 года), выделили 61 штамм микроорганизмов и идентифицировали их как бактерии рода Enterococcus с помощью бактериологических методов исследований (выделение чистой культуры микроорганизма на среде «Энтерококкагар» (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск, Россия) с добавлением 1,5% дрожжевого экстракта). Далее идентификация проводилась методом полимеразной цепной реакции.

Штаммы идентифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров (табл. 1) по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы. Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (Москва). Для обнаружения генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, проводили мультиплексную ПЦР с 1 мкл лизата в термоциклере «Терцик» (ДНК Технология, Россия) по следующему протоколу: 1 цикл – 92 °C, 4 мин; 30 циклов: 92 °C, 30 сек; 55 °C, 1 мин; 72 °C, 1 мин; последний цикл включал элонгацию в течение 7 мин при 72 °C. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, ТАЕ буферной системе. В качестве маркеров использовали GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс.

Изучение устойчивости к антибиотикам проводилось диско-диффузионным методом, основанным на способности антибиотика диффундировать из пропитанных ими дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, на поверхности питательных сред [6]. Диски с антибиотиками были представлены препаратами групп аминогликозидов, фторхинолонов, макролидов, тетрациклина стрептомицина. Для оценки чувствительности к антимикробным препаратам использовали критерии интерпретации результатов определения чувствительности Enterococcus spp. МУК 4.2.1890-04 (табл. 2).

Статистическая обработка данных производилась в программе Statistica 10. Графики и таблице формировались в программе Excel.

Результаты исследования

Исследование чувствительности к антибиотикам бактерий рода Enterococcus, выделенных из р. Вторая Речка, показало, что большинство штаммов были чувствительны к тетрациклину и составляли 80% (n = 49) от всех штаммов исследуемой группы, промежуточной устойчивостью обладали 5% (n = 3), а 15% (n = 9) были резистентны к антибиотикам. По отношению к стрептомицину было обнаружено 11% (n = 7) чувствительных штаммов, 23% (n = 14) промежуточно-устойчивых и 66% (n = 40) резистентных; к эритромицину – 16% чувствительных (n = 10), промежуточно-устойчивых 56% (n = 33) и 30% (n = 18) резистентных; к ампициллину было чувствительно 95% (n = 58) и 5% (n = 3) резистентно. К левофлоксацину 84% (n = 51) исследуемой коллекции было чувствительно, 10% (n = 6) – промежуточно-устойчиво и 6% (n = 4) резистентно; к рифампицину – 18% (n = 11) чувствительных, промежуточно-устойчивых 10% (n = 6) и 72% (n = 44) резистентных; к гентамицину – 87% (n = 52) чувствительных штаммов, 3% (n = 2) промежуточно-устойчивых и 10% (n = 6) были резистентными: при этом к ванкомицину было обнаружено 72% (n = 44) чувствительных, промежуточно-устойчивых 25% (n = 15) и 3% (n = 2) резистентных (рис. 1).

Анализ полирезистентности в р. Второй Речке показал, что большинство штаммов проявляли резистентность к двум антибиотикам, а именно 41% (n = 25), при этом 20% (n = 12) были резистентными к трем антибиотикам, четырем антибиотикам – 8% (n = 5) и только 2% (n = 1) – к шести антибиотикам. Также стоит отметить, что было 8% (n = 5) штаммов, не проявлявших резистентность, однако среди них встречались и штаммы с промежуточной устойчивостью (рис. 2).

Обсуждение полученных данных

В настоящее время одним из маркеров антропогенного влияния на окружающую среду является устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам [7]. Появляется все больше исследований, в которых пытаются оценить масштабы распространения антибиотико-резистентных микроорганизмов, что используется как признак антропогенного влияния человека на окружающую среду [2]. Чаще всего это замечают эпидемиологи, так как существует возможность распространения инфекций [8]. Тем не менее для экологов эта проблема также не остается незамеченной, поскольку в случае сосуществования аллохтонных и автохтонных микроорганизмов может произойти горизонтальный перенос генов, а точнее ген устойчивости к антибиотикам от автохтонных к аллохтонам и наоборот [7].

Поскольку энтерококки сохраняются в воде непродолжительное время, а также относительно устойчивы к факторам внешней среды, таким как температура, рН, солнечное излучение, соленость воды и некоторые дезинфицирующие вещества [9], то представители рода Enterococcus были рекомендованы в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для исследования пресной и морской воды, что нашло отражение в Методических указаниях МУК 4.2.1884-04; МУ 4.2.2959-11. Более современные исследования продемонстрировали, что использование стандартных методов, которые основаны на культивировании бактерий, могут привести к неточной оценке их фактического количества в окружающей среде, поскольку они могут переходить в жизнеспособное, но некультивируемое состояние [10].

Отсутствие научного управления и надлежащего планирования приводит к чрезмерному использованию антибактериальных веществ, тем самым увеличивая распространения в микробиоме окружающей среды генов с устойчивостью к антибиотикам [11]. Количество внеклеточных и внутриклеточных генов с устойчивостью к антибиотикам значительно увеличивается при хлорировании на очистных сооружениях и в тепличных почвах с фунгицидами [12]. Более того, разбавленные и оставшиеся в окружающей среде антибактериальные вещества могут повысить устойчивость бактерий за счет фенотипической адаптации, генных мутаций и горизонтального переноса генов [13]. Помимо этого, постоянное воздействие антибактериальных веществ на бактерии способствует развитию их устойчивости. Скорость роста устойчивых к антибактериальным веществам бактерий растет, что значительно снижает их эффективность [14]. Часто обнаруживают бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, которые представляют серьезную угрозу для здоровья человека и экосистемы. Отчеты о механизме устойчивости к антибактериальным веществам недостаточно полны, а сводные данные о распространении устойчивости к антибактериальным веществам упоминаются редко [15], поэтому необходимо помимо устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам уделить внимание резистентности представителей рода Enterococcus к антибактериальным веществам.

Изучение антибиотикорезистентности у штаммов рода Еnterococcus, выделенных из р. Вторая Речка, показало, что отмечается повышенный уровень устойчивых к рифампицину и стрептомицину, более того, устойчивость к ванкомицину обнаружена у 3% (n = 2) выделенных штаммов. Выделенная в реке Вторая Речка популяция штаммов энтерококков характеризовалась резистентностью к двум антибиотикам 41% (n = 25), однако был выделен один штамм, который обладает полирезистентностью к шести антибиотикам. Чаще всего встречалась резистентность к сочетанию таких антибиотиков, как стрептомицин, рифампицин и эритромицин. Общность характера формирования устойчивости к аминогликозидам, а также значительная доля резистентных к стрептомицину штаммов позволяет предположить возможность появления ванкомицин-устойчивых штаммов энтерококков в ближайшем будущем, что является чрезвычайно актуальным для санитарно-микробиологической и гигиенической характеристики среды пребывания человека.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.