Особенности распределения HIF-1α- и HIF-2α-иммунопозитивных нейронов в коре головного мозга у старых крыс после экспериментального инфаркта миокарда

При инфаркте миокарда (ИМ), как и при многих других хронических заболеваниях с нарушениями транспортной функции крови, органы и ткани постоянно испытывают недостаток кислорода [1][2][3]. Важное место в адаптации организма к циркуляторной гипоксии отводится индуцируемому гипоксией фактору-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1, HIF-1) – специфическому регуляторному белку, активность которого увеличивается при снижении напряжения кислорода в крови [4]. HIF-1α долгое время рассматривался в качестве главного медиатора адаптивных процессов при гипоксии, однако в исследованиях последних лет было показано, что HIF-2α является не менее важным регулятором этих процессов [5]. Однако в обширной литературе, посвященной этому вопросу, мы не встретили материалов об особенностях экспрессии HIF-1α и HIF-2α в нейронах коры мозга в динамике развития ИМ.

Цель работы состояла в сравнительном изучении количественного содержания HIF-1α- и HIF-2α-иммунопозитивных нейронов (HIF-1α- и HIF-2α-нейроны) в префронтальной коре головного мозга крыс в разные временные периоды развития экспериментального ИМ.

Материалы и методы

Исследование выполнено на префронтальной коре 24-месячных белых крысах-самцах линии Вистар массой 280–320 г. Всех животных содержали на стандартном рационе в одинаковых условиях лабораторного вивария. Животных произвольно выделили в две группы: контрольную (n = 15) и экспериментальную (n = 23). Исследование проводилось в соответствии с требованиями «Правил лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 708-н от 23.08.2010 г.) и Директивы Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях (2010/63/EU). При содержании животных и выведении их из эксперимента руководствовались законом «О защите животных от жестокого обращения» (гл. V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.). Протокол исследования утвержден на заседании локального этического комитета ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 5 от 17.01.2022 г.).

Крыс помещали в индукционную камеру, в которой проводили ингаляцию паров севорана (Asika Queenborough LTD, Великобритания) до утраты двигательной активности и реакции на болевой раздражитель, после чего фиксировали на манипуляционном стенде. В асептических условиях осуществляли разрез кожи грудной клетки размером около 2 см, раздвигали грудные мышцы до появления реберных дуг и межреберных мышц. Затем контрольным животным операционную рану ушивали, а экспериментальным – через межреберный промежуток в толщу миокарда передней стенки сердца атравматичной иглой с тройным покрытием силиконом (30G SF Medical Products GMBH, Германия) вводили 0,25 мл 1,5% сосудистого склерозирующего препарата этоксисклорол (Kreissler Chemische Fabrik, Германия) по описанной ранее методике [6].

В экспериментальной группе погибли 8 крыс, оставшихся забивали декапитацией через 15, 30 и 45 суток после оперативного вмешательства. Головной мозг извлекали из полости черепа, фиксировали в течение 4 ч при 4 °С в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 7,4) и заливали в парафин общепринятым методом.

Иммуногистохимическое исследование префронтальной коры мозга проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 7 мкм, один из которых обрабатывали для выявления HIF-1α, следующий за ним – HIF-2α. Срезы монтировали таким образом, чтобы на стекле одновременно находились образцы, полученные от контрольных и экспериментальных животных каждой временной группы. После ингибирования эндогенной пероксидазы в 1% растворе H₂O₂ и подавления неспецифического связывания антител в 1% нормальной сыворотке лошади срезы инкубировали в течение 18 ч при 4 °С с моноклональными антителами мыши против HIF-1α и HIF-2α (разведение 1: 500; Abcam, Великобритания). Затем срезы промывали в нескольких сменах 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7,2) и инкубировали 2 ч в растворе вторичных биотинилированных антител (Vector Labs, США) в разведении 1 : 200. После отмывания срезы инкубировали в течение 1 ч с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, США) при температуре 22–24 °С в темноте, после чего их трижды промывали в PBS. Продукты реакции визуализировали с использованием хромогена (Peroxidase Substrate Kit, Vector NovaRED, SK-4800), контролируя процесс окраски под микроскопом. Инкубацию с первичными антителами осуществляли при 4 °С, обработку вторичными антителами и хромогеном выполняли в соответствии с рекомендациями фирм производителей. Некоторые срезы докрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым по Нисслю.

Животных выводили из эксперимента декапитацией, затем вскрывали грудную полость и для верификации диагноза извлекали сердце. У экспериментальной группы животных на грудино-реберной поверхности сердца формируются ограниченные очаги, которые на 15-е, 30-е и 45-е сутки после оперативного вмешательства представлены небольшими (1–3 мм) рубцами сероватого цвета. У контрольных животных изменений макроструктуры сердца не отмечено.

Содержание иммунопозитивных нейронов изучали у каждого животного при объективе 40× на стандартной площади среза префронтальной коры равной 0,105 мм². Препараты просматривали под микроскопом Leica DMRXA (Leica, Германия) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата Leica EC3 (Leica, Германия). Количественные исследования проводили на трех последовательных срезах каждого образца с помощью программы анализа изображения ImageScope (Leica, Германия). Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Для оценки достоверности полученных результатов использовали критерий Манна – Уитни. Достоверными считались различия при p < 0,05. Результаты экспериментов выражали как среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (SEM).

Результаты исследования

Иммуногистохимический маркер HIF-1α выявляется в небольшом количестве нейронов, артериол и капилляров коры мозга у контрольных и экспериментальных животных (рис. 1, а–в), HIF-2α – только у крыс с ИМ (рис. 1, г, д). Во всех случаях преципитат в иммунопозитивных структурах выпадает в виде мелких гранул, окрашивая их в зависимости от плотности отложения продукта реакции в различные оттенки коричневого цвета.

Наиболее выраженные количественные изменения HIF-1α-нейронов наблюдаются на 15-е сутки после моделирования ИМ, когда их содержание по сравнению с контрольными показателями увеличивается на 24,7% (p < 0,05), достигая максимального уровня (рис. 2). В этот период на срезах лобной доли мозга выявляются многочисленные нейроны с интенсивной реакцией, окрашенные в темно-коричневый цвет (рис. 1, б). Затем количество этих клеток сокращается, тем не менее остается значимо выше контрольных цифр (р < 0,05). На 45-е сутки развития ИМ на препаратах определяется относительно небольшое число HIF-1α иммунопозитивных нейронов, в большинстве из которых плотность отложения гранул преципитата невысока, в результате чего клетки окрашены в желтовато-коричневый цвет (рис. 1, в).

Особенности количественных преобразований HIF-2α-нейронов в префронтальной коре в разные сроки развития ИМ представлены на диаграмме (рис. 2). Клетки, маркированные HIF-2α, начинают выявляться в коре мозга в количестве достаточном для статистических исследований только на 30-е сутки ИМ. На этом этапе развития ИМ большинство иммунопозитивных нейронов окрашены в желтовато-коричневый цвет (рис. 1, г). Однако на 45-е сутки их количество увеличивается почти вдвое (р < 0,05). В этот период на срезах лобной доли мозга особенно часто встречаются нейроны темно-коричневого цвета с высокой плотностью отложения продукта реакции, хотя рядом с ними нередко рядом с ними находятся нейроны с умеренной и низкой интенсивностью реакции (рис. 1, д).

Обсуждение полученных данных

К настоящему времени представлены убедительные доказательства причинно-следственной связи между поражением сердечно-сосудистой системы и изменениями, проходящими в центральной нервной системе [1][2]. Для пациентов пожилого возраста, составляющих основной контингент кардиологических больных, расстройства психической деятельности имеют выраженные негативные последствия, катастрофически изменяя качество жизни [7][8]. Снижение когнитивных функций у больных, перенесших ИМ, часто играет более важную роль в социально-трудовой реабилитации, чем прямые последствия самого ИМ [2].

Предполагается, что психическая патология, нередко формирующаяся в постинфарктном периоде, во многом обусловлена гемодинамическими изменениями, приводящими к циркуляторной гипоксии различных отделов головного мозга, включая его когнитивные центры [2][4]. К таким центрам относится, в том числе, префронтальная кора – передняя часть лобных долей, имеющая многочисленные связи с другими кортикальными образованиями, субкортикальными и стволовыми нейронами.

Полученные нами данные свидетельствуют о клеточно-специфических особенностях экспрессии HIF-1α и HIF-2α в префронтальной коре экспериментальных животных, что, возможно, связано с различиями интенсивности их кислород-зависимой деградации, являясь определяющим фактором разной чувствительности нейронов к постинфарктной гипоксии. Даже в одноименных популяциях клеток HIF-1α и HIF-2α могут вызывать экспрессию различных генов, обеспечивающих, в том числе, неодинаковую продолжительность адаптации клеток к гипоксии [9]. При развитии гипоксии HIF-1α накапливается в клетке и в комплексе с HIF-1β воздействует на так называемые гипоксия-реакционные элементы (hypoxia response elements, HRE), содержащиеся в генах, продукты которых опосредуют работу адаптивных белков, связанных с энергетическим метаболизмом, эритропоэзом, апоптозом, пролиферацией клеток и другими процессами, обеспечивающими приспособительные реакции организма к гипоксии [9]. Активация HRE является ключевым моментом в цепи событий, начинающихся в клетке после того, как происходит снижение концентрации кислорода в ее окружении. Взаимодействуя с энхансером гена эритропоэтина, HRE опосредует увеличение выработки эритроцитов, открытие нефункционирующих капилляров и интенсификации неоангиогенеза [10].

Тем не менее, по нашим данным в префронтальной коре контрольных животных маркер HIF-1α определяется в ограниченной популяции нейронов, лежащих в поверхностных и глубоких слоях неокортекса. И хотя плотность отложения продукта реакции в большинстве таких клеток невелика, его должно быть достаточно для базовой индукции генов, обеспечивающих поддержание функциональной активности клетки и прежде всего синтез энергии [10][11]. В нормоксических условиях экспрессия HIF-1α в тканях поддерживается несколькими процессами, но в первую очередь постоянно протекающей в цитозоле протеасомной деградации, инициируемой двумя независимыми кислород-зависимыми реакциями: пролил и аспарагин гидроксилированием с последующей убиквитинацией [4].

HIF-1α и HIF-2α относятся к одному семейству стабилизирующих гипоксию факторов и соединяются с идентичной мишенью в последовательности ДНК [9][12]. Однако морфофункциональная организация каждой из этих регуляторных молекул имеет свои особенности. Как показали наши наблюдения, иммуногистохимический маркер HIF-1α выявляется в коре мозга как у контрольных, так и экспериментальных животных, тогда как HIF-2α-позитивные структуры – только в поздние сроки постинфарктного периода. Через 15 суток после моделирования ИМ содержание HIF-1α-нейронов достигает наибольших значений, тогда как интенсивно окрашенные нейроны, маркированные HIF-2α, в большом количестве определяются в коре мозга лишь на 45-е сутки ИМ, когда содержание HIF-1α-нейронов сокращается до минимального уровня, что указывает на скоординированное по времени участие обоих протеинов в обеспечении системной реакции организма на гипоксию.

Несмотря на очень близкое строение этих протеинов, каждый из них контролирует определенные биологические характеристики клеток, связанные, в том числе, с ответной реакцией на гипоксию. Ранее в жестких гипоксических условиях на культуре эндотелиальных клеток было показано, что из-за уменьшения стабильности мРНК повышенный уровень экспрессии HIF-1α через короткое время возвращается к исходным значениям, тогда как, содержание мРНК HIF-2α еще некоторое время остается на высоком уровне [4][12].

Адаптация к гипоксии обеих регуляторных молекул осуществляется универсальным путем: через конформационные изменения HIF, увеличение продукции эритроцитов и образование новых путей их доставки [9][10][11]. В нейронах развивается дисфункция митохондрий, провоцирующая нарушение энергетического метаболизма [13]. Одновременно увеличивается накопление фосфоркреатина и его расходование на синтез АТФ, что является дополнительным фактором, способствующим адаптации к гипоксии [14].

Тем не менее, приведенные выше данные, свидетельствуют о специфичности работы HIF-1α и HIF-2α в нейронах префронтальной коры головного мозга у крыс в процессе развития ИМ. Даже в одноименных популяциях клеток HIF-1α и HIF-2α могут вызывать экспрессию различных генов, обеспечивающих, в том числе, разную продолжительность адаптации нейронов к гипоксии. HIF-1α, по-видимому, отвечает за формирование срочной адаптации нейронов коры мозга к гипоксии, HIF-2α – долговременной.

Гипоксия является типовым патологическим процессом, сопровождающим различные хронические болезни, включая ИМ. Вследствие низкого сердечного выброса и развития гипоперфузии доставка кислорода к тканевым структурам мозга сокращается до уровня, недостаточного для адекватного обеспечения метаболизма, что вызывает изменения всех компонентов нейро-сосудистых единиц [15]. При ИМ, наблюдающемся в пожилом возрасте, системные нарушения накладываются на возрастные изменения, вследствие чего адаптационные резервы быстро истощаются, а явления хронической гипоксии нарастают. Появляются нейродегенеративные изменения, в первую очередь, кислород чувствительных нейронов и белого вещества лобной коры, и как следствие, усугубляются когнитивные нарушения функций мозга.

Заключение

Несмотря на очень близкое строение HIF-1α и HIF-2α, каждый из них вызывает экспрессию различных генов, обеспечивающих неодинаковую продолжительность адаптации нейронов префронтальной коры к постинфарктной гипоксии. HIF-1α, вероятно, отвечает за формирование срочной адаптации нейронов коры мозга к гипоксии, в то время как HIF-2α – долговременной. В период наиболее выраженного снижения индукции HIF-1α в нейронах коры мозга наблюдается активация HIF-2α, что указывает на скоординированное по времени участие обоих протеинов в обеспечении системной реакции организма.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: авторы заявляют о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ЧВМ,

Сбор и обработка материала – КАЕ

Статистическая обработка – КАЕ, РТЕ

Написание текста – ЧВМ

Редактирование – ЧВМ