Оценка цитотоксичности биостекол, допированных бором или висмутом и полученных разными способами

В последнее время перспективными становятся исследования остеогенных, остеоиндуктивных и остеокондуктивных материалов, одним из представителей которых являются биоактивные стекла (биостекла) [1]. Биостекла представляют собой универсальный, совместимый с организмом материал, находящий активное применение в современной науке. Область их применения лежит в сфере костной трансплантологии, разработке способов замещения костной ткани и стимуляции остеогенеза, регенерации костной ткани, а  также в качестве систем доставки лекарств или противомикробных препаратов [2]. Наиболее известный состав был разработан Ларри Хенчем и получил название Bioglass 45S5 [3]. Образец проявил способность к связыванию с тканями организма и стимулированию остеогенеза путем высвобождения биоактивных ионов [4]. Исследователями разных научных групп предложены варианты модификации биостекол [5]. Показано, что допирование биостекол «терапевтическими» ионами влияет на изменение структуры биостекла и его свойств [5]. Добавление ионов металлов, таких как магний, стронций, марганец, железо, цинк, повышает биоактивные свойства стекла, что способствует заживлению и регенерации тканей [5].

В рамках настоящего исследования на базе лаборатории переработки минерального сырья Института химии ДВО РАН (зав. д-р хим. наук, профессор М.А. Медков) были получены Bioglass 45S5, допированные ионами бора и висмута. Введение бора обусловлено его влиянием на усиление остеогенных, антибактериальных и ангиогенных свойств [6–8]. Допирование висмутом, согласно литературным данным, придает биостеклу радиопротективные свойства, а также благотворно влияет на остеогенный потенциал [9][10]. С целью первоначальной оценки безопасности применения полученных материалов на базе Междисциплинарного лабораторного центра ТГМУ (зав. д-р мед. наук, профессор Е.В. Маркелова) проведена оценка цитотоксичности на культуре клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ).

Материалы и методы

Для получения исходных образцов биостекла использовали методы твердофазного синтеза (далее Bioglass 45S5 (окс.)) и пиролиза органических растворов (далее Bioglass 45S5 (орг.)). Bioglass 45S5 (окс.) получен из компонентов SiO₂, NaCO₃, CaCO₃, (NH₄)₂HPO₄ путем изготовления гомогенной шихты и плавления массы при температуре 1300 °C. Стекло Bioglass 45S5 (орг.) получено из прекурсоров C₁₈H₃₃O₂Na, C₃₆H₆₆O₄Ca, C₈H₂₀O₄Si, C₁₂H₂₇O₄P, растворенных в толуоле. Растворитель удаляли при 150 ºС, массу подвергали пиролизу при температуре 1300 ºС. Квалификация использованных реактивов – не ниже ХЧ. Допирование предварительно измельченного стекла проведено твердофазным методом при температуре спекания 1300 °C. Получены образцы, допированные 40 масс.% Bi₂O₃ и 15 масс.% B₂O₃.

Для исследований цитотоксичности использовали следующие образцы стекла: Bioglass 45S5 (окс.), Bioglass 45S5 (орг.), Bioglass 45S5 (орг.) + 40% Bi₂O₃, Bioglass 45S5 (орг.) + 15% B₂O₃. А также образец стеклокерамики Bioglass 45S5 (окс.) + 40% Bi₂O₃, в котором присутствуют кристаллы Na₂CaSi₃O₈ и Bi₂O₃. Bioglass 45S5 (окс.) и Bioglass 45S5 (орг.) рассматривали как образцы сравнения. Образцы были подготовлены для исследований в виде порошков и внесены отдельными навесками по 100; 50; 25; 12,5 мг и простерилизованы в сухожаровом шкафу Thermo Scientific Heraterm (Thermo Fisher, CША) при 160 °C в течение 2 часов. В качестве модели для проведения теста на цитотоксичность выбрана культура асцитной аденокарциномы Эрлиха. Клетки АКЭ вносили в 12-луночные планшеты по 1000 мкл в концентрации 2 × 10⁶ кл/мл питательной среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Lonza, Verviers, Бельгия), с 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologics Inc., США) и 0,05% гентамицина (Sigma Aldrich, США). Подготовленные культуральные планшеты оставляли в инкубаторе Thermo Scientific 8000WJ (Thermo Fisher, США) при поддержании условий 5% CO₂, 37 °C. Через 24 часа осуществляли замену питательной среды до конечного объема 1000 мкл в ячейке. Еще через 1 сутки вносили навески исследуемых веществ. Изучение цитотоксичности материалов проводили через 2 сут контакта методом теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромидом (МТТ, ПанЭко, Россия) на метаболическую активность клеток. Интенсивность оптической плотности после восстановления формазана определяли спектрофотометрически при λ = 570 нм на планшетном ридере FlexA-200 HT (Allsheng, Китай), референсная λ = 800 нм. Измерения проводили в трехкратной повторности. В качестве положительного контроля (К⁺) выбраны клетки с добавлением 20% диметилсульфоксида (ПанЭко, Россия), отрицательного контроля (К⁻) – интактные клетки.

Статистическую обработку выполняли в программном комплексе MS Excell 365. Для оценки характера распределения применяли критерий Шапиро – Уилка. В случае нормального распределения данных значимость полученных различий оценивали с применением критерия Стьюдента, уровень значимости принимали за p < 0,05. В случае распределения, отличного от нормального, значимость наблюдаемых различий оценивали с применением критерия Манна – Уитни.

Результаты исследования

Результаты МТТ-теста свидетельствуют о том, что после 2-суточного контакта с 12,5–100 мг/мл образца стеклокерамики Bioglass 45S5 (окс.) + 40% Bi₂O₃ жизнеспособность клеток АКЭ составляет от 16,41 ± 0,82 до 93,64 ± 4,68%. Для образца стекла Bioglass 45S5 (орг.) + 40% Bi2O3 во всем диапазоне количество метаболически активных клеток составляет от 92,36 ± 4,62 до 93,93 ± 4,70%. При этом для образца сравнения Bioglass 45S5 (окс.) определен больший токсический эффект, чем для материалов, полученных органическим способом, что полностью соотносится с выше-указанными результатами (рис. 1).

Для образца Bioglass 45S5 (орг.), допированного 15% B₂O₃, по данным МТТ-теста нетоксичной является только концентрация 12,5 мг/мл, в то время как для 12,5–100 мг/мл варьирует от 95,11 ± 4,76 до 11,52 ± 0,58% (рис. 2).

Обсуждение полученных данных

Основываясь на полученных данных, следует отметить, что материалы, полученные методом пиролиза органических растворов, являются наиболее перспективными для дальнейших исследований в концентрациях 12,5 и 25 мг/мл. Применение стекла, допированного 15% B₂O₃, в концентрации 12,5 мг/мл также представляет интерес, поскольку, согласно литературным данным, боросиликатные стекла обладают более высокой скоростью образования гидроксиапатита и формирования новой костной ткани в сравнении с недопированным Bioglass 45S5 [10][11]. Такой материал более термостабилен, что необходимо нам в дальнейшем с целью создания 3D-каркасов для замещения и регенерации костных эффектов [12].

Известно, что висмут-содержащие биостекла могут применяться для регенерации костей [9][10], а также в терапии онкологических патологий костной ткани [13], дополнительно обладая антибактериальным эффектом [14]. Согласно данным МТТ-теста, потенциалом для будущего применения в большей степени обладают стекла с добавлением 40% Bi₂O₃ методом пиролиза органических растворов.

Заключение

Методом калориметрического МТТ-теста проведена оценка цитотоксических свойств разрабатываемых образцов биостекла на модели культуры клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха. Показано, что добавление ионов бора в состав биостекла повышает параметр цитотоксичности, в то время как введение висмута в состав органического биостекла, в отличие от полученного оксидным способом, сохраняет клетки жизнеспособными. Согласно полученным данным, для дальнейших исследований будут применяться материалы Bioglass 45S5 (окс.) + 40% Bi₂O₃, Bioglass 45S5 (орг.) + 15% B₂O₃, Bioglass 45S5 (орг.) + 40% Bi₂O₃ в концентрации 12,5 мг/мл.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства «Приоритет-2030» (ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России) и государственного задания ФГБУН «Институт химии ДВО РАН», тема «Направленный синтез и исследование строения и свойств новых веществ, материалов и покрытий (включая наноразмерные) для морских технологий и техники и различного функционального назначения» (FWFN(0205)-2022-0003).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ЧИН, ШОВ, ГДН, ММА, МЕВ

Сбор и обработка материала – ЧИН, ШОВ

Статистическая обработка – ЧИН

Написание текста – ШОВ, ЧИН

Редактирование – ГДН, ММА, МЕВ