Сравнительная оценка эффективности полигексанида и Тригексилона® против биопленок карбапенемазопродуцирующих K. pneumoniae и P. aeruginosa

Несмотря на достижения современной медицинской науки, в настоящее время частота развития перипротезной инфекции (ППИ) составляет 1,63 и 1,55% случаев после первичных операций по эндопротезированию тазобедренного и коленного суставов соответственно [1]. В этиологии ППИ ведущую роль занимают различные виды стафилококков, суммарный вклад которых в спектр возбудителей оценивается в 50% [2], при этом доля грамотрицательных возбудителей (P. aeruginosa, K. pneumoniae) составляет 15–20% [3, 4]. Однако выделение грамотрицательного возбудителя является самостоятельным предиктором неблагоприятного исхода комплексного лечения таких пациентов [3]. Наличие у бактерий различных механизмов резистентности к антибиотикам, включая продукцию ферментов, ин-активирующих антибактериальные препараты, а также формирование на поверхности имплантированных ортопедических конструкций и окружающих тканях микробных биопленок ведет к неэффективности антибактериальной терапии.

Биопленки вносят значительный вклад в развитие хронических инфекций за счет необратимого прикрепления к биотическим (различные ткани организма) и абиотическим (медицинские имплантаты, катетеры) поверхностям [5]. После созревания биопленку чрезвычайно сложно элиминировать, что приводит к длительным и рецидивирующим инфекциям. Биопленки ответственны примерно за 80% трудно поддающихся лечению длительных инфекций, что представляет собой значительную проблему в системе здравоохранения. Сесильные бактерии демонстрируют заметно повышенную устойчивость к антибиотикам по сравнению с планктонными клетками, что связано с ограниченным доступом лекарств, дефицитом питательных веществ и адаптивными реакциями на неблагоприятные условия [5]. Патогены защищены от факторов иммунной системы хозяина за счет окружения многокомпонентным матриксом, создающим физическое препятствие для иммунных клеток. В ряде случаев биопленки могут вызывать иммунологические реакции, которые приводят к повреждению окружающих тканей [5]. Бактерии с множественной лекарственной устойчивостью чаще формируют микробные биопленки на поверхностях установленных имплантатов и фрагментах костной ткани по сравнению с анти- биотикочувствительными бактериями [6].

Применение местных антисептических средств является одной из основных методик в комплексном лечении инфицированных ран [7]. Примерами современных антисептиков являются полигексанид, октенидина дигидрохлорид или повидон-йод. Следует отметить, что широко используемый антисептик хлоргексидин исключен из протоколов по лечению раневых инфекций из-за растущей к нему резистентности бактерий и возможности развития перекрестной устойчивости патогенов к антибиотикам [8].

Цель исследования – сравнительная оценка действия полигексанида и нового отечественного антисептика Тригексилон® на сформированные биопленки карбапенемазопродуцирующих K. pneumoniae и P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ортопедической инфекцией.

Материалы и методы

В исследование включены клинические штаммы K. pneumoniae (n = 3) и P. aeruginosa (n = 3) с минимальной ингибирующей концентрацией карбапенемов выше 2 мг/л. Выделение клинических изолятов K. pneumoniae и P. aeruginosa выполняли проспективно в 2025 году в соответствии с международными стандартами микробиологических исследований. Видовую идентификацию выполняли методом MALDI-TOF MS с использованием системы FlexControl и программного обеспечения MBT Compass 4.1., Score ≥ 2,0. Номер штамма соответствует его идентификационному номеру в системе лабораторной информационной системы «Акросс-Инжири». Чувствительность K. pneumoniae изучали к 18 антибактериальным препаратам, P. aeruginosa – к 11 в соответствии с требованиями EUCAST v.15.0 (табл. 1).

Бактериальную ДНК выделяли с использованием набора «ДНК-Сорб-АМ» согласно инструкции производителя (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Детекцию генов карбапенемаз групп KPC/OXA-48 и металло-бета-лактамаз группы NDM осуществляли методом Real-time PCR с использованием наборов реагентов с гибридационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL» и «АмплиСенс MDR MBL-FL» (Интерлабсервис, ФБУН ЦНИИЭ, Россия) на приборе «Амплификатор Real-time CFX96 Touch» (BioRAD, США).

Биопленки K. pneumoniae и P. aeruginosa формировали в полистироловых 96-луночных плоскодонных планшетах в течение 48 часов. Для этого в лунки планшета вносили 180 мкл стерильного бульона LB и 20 мкл взвеси суточной культуры бактерий (0,5 по шкале МакФарланда). Через двое суток промытые, высушенные лунки обрабатывали 200 мкл 0,2% раствора полигексанида («Лавасепт», Солюфарм, Германия) или Тригексилоном® (3-ГСН) на основе водорастворимого трихелатного комплекса хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетата, (Росбио, Россия) в концентрации 2,8–3,6 мг/мл в течение 5, 10, 20, 40 минут. Контрольные лунки обрабатывали физиологическим раствором.

Деструктивное действие антисептиков определяли путем окраски сформированных и промытых после антисептиков биопленок 0,1% раствором генцианвиолета в сравнении с контролем. Суммарную биомассу сформированных пленок оценивали по оптической плотности (ОП) полученных спиртовых экстрактов связавшегося красителя при 570 нм на спектрофотометре «Spectrostar Nano». Статистически значимое снижение ОП экстрактов красителя опытных лунок в сравнении с ОП контрольных лунок считали достаточным временем для разрешения биомассы микробной пленки.

Для определения влияния антисептиков на сесильные бактериальные клетки после промывки в каждую лунку с биопленкой добавляли 190 мкл среды LB и 10 мкл водного раствора резазурина (Eugen). Микропланшеты инкубировали в течение 2 часов в темноте при 37 °С. Изменение цвета с синего на розовый указывает на восстановление резазурина живыми бактериальными клетками. Эффективной считали длительность экспозиции антисептика, при которой не регистрировали изменение окраски резазурина, подтверждающее угнетение метаболической активности бактерий.

Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью программы GraphPad Prism 9.0 (США) с использованием t-теста. Значения p < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты исследования

Все протестированные штаммы K. pneumoniae и P. aeruginosa характеризовались устойчивостью ко всем антибактериальным препаратам за исключением колистина и продуцировали карбапенемазы различных групп. Так, 2 изолята P. aeruginosa были продуцентами карбапенемазы группы VIM, один – IMP. У всех K. pneumoniae определяли ферменты группы NDM, причем у штамма № 1833 определяли наличие двух карбапенемаз – NDM и OXA-48.

Все включенные в исследование штаммы были чувствительны к полигексаниду и 3-ГСН и образовывали биопленки. Установлено, что оба антисептика эффективно снижали биомассу сформированных биопленок P. aeruginosa и K. pneumoniae (рис. 1).

Показано, что полигексанид был более эффективен в сравнении с 3-ГСН против сформированных биопленок K. pneumoniae № 1833. В отношении биопленок остальных штаммов данного вида антисептики демонстрировали практически одинаковую активность и статистически значимо снижали биомассу 48-часовых биопленок уже через 5 минут экспозиции.

Выявлено, что 3-ГСН при экспозиции 5 минут не оказывал эффективного деструктивного действия на биопленки IMP-продуцирующего изолята P. aeruginosa № 4695 (рис. 2).

Статистически значимое снижение биомассы регистрировали при экспозиции более 10 мин. Кроме того, данный препарат не разрушал биопленки штамма № 5019 даже при максимальном времени воздействия – 40 минут. В свою очередь, полигексанид был эффективен в отношении всех сформированных биопленок P. aeruginosa уже через 5 минут экспозиции.

Особый интерес представляет собой оценка влияния антисептиков на сессильные бактериальные клетки в составе биопленок. Определено, что оба тестируемых антисептика демонстрировали антибактериальное действие в отношении бактериальных клеток P. aeruginosa и K. pneumoniae в составе биопленок (табл. 2).

Выявлено, что под действием 3-ГСН 2 в составе биопленок, сформированных P. aeruginosa 4695 и 5018, сохранялись метаболически активные бактериальные клетки, о чем свидетельствовало незначительное изменение цвета резазурина.

Таблица 2

Метаболическая активность сессильных бактерий в присутствии резазурина после обработки лунок антисептиком

Антисептик	№ штамма	5 минут	10 минут	20 минут	40 минут	К+	К-
K. pneumoniae
0,2% раствор полигексанида	7654
	1997
	1833
3-ГСН 2,8–3,6 мг/мл	7654
	1997
	1833
P. aeruginosa
0,2% раствор полигексанида	4695
	1819
	5019
3-ГСН 2,8–3,6 мг/мл	4695
	1819
	5019

Обсуждение полученных данных

Устойчивые к карбапенемам Enterobacterales (CRE) имеют особое значение из-за их высокой устойчивости, в том числе к антибиотикам расширенного спектра из других групп препаратов, и классифицируются как продуценты (CP-CRE) и непродуценты (non-CP CRE) карбапенемаз [9]. Продукция карбапенемаз является наиболее важным механизмом защиты среди карбапенем-устойчивых штаммов K. pneumoniae [10]. В нашем исследовании все три штамма данного вида характеризовались продукцией металло-β-лактамаз группы NDM и один из них был также продуцентом сериновой OXA-48. Среди изученных изолятов P. aeruginosa регистрировали 2 типа карбапенемаз – VIM и IMP.

Растущее количество устойчивых к антибиотикам возбудителей, в том числе карбапенем-устойчивых грамотрицательных бактерий, все больше ограничивает применение классических схем лечения антибактериальными препаратами [5, 11]. Наличие неорганических поверхностей имплантатов и биоматериалов способствует образованию биопленки, снижая проникновение антибиотиков в сформированные зрелые микробные сообщества [12]. Поэтому, несмотря проведение системной этиотропной антибактериальной терапии, сохраняется очаг инфекции, который становится причиной неэффективности консервативного лечения, развития рецидива и необходимости повторной операции с удалением инфицированного имплантата. Эти проблемы подчеркивают необходимость в альтернативных стратегиях, в частности локальном применении антисептиков и использовании резервных антибактериальных препаратов.

Адаптивные механизмы резистентности бактерий к антибиотикам вызывают глобальную обеспокоенность в отношении современных и классических фармацевтических методов лечения [13]. Большое значение в травматологии и ортопедии имеет радикальная хирургическая обработка очага с удалением зрелых биопленок на пораженных тканях и имплантатах с локальной обработкой местными антисептиками. Такая методика обеспечивает механическую очистку и антимикробную защиту для эрадикации возбудителя и его биопленки. Большинство существующих на сегодня эффективных стратегий противодействия процессу биопленкообразования являются экспериментальными и не внедрены в клиническую практику.

Использование антисептиков широко применяется в различных отраслях медицины и является одним из методов, обеспечивающих антибиопленочное действие [14]. K. Barrigah-Benissan и соавт. [14] показали, что различные антисептики (гипохлорит натрия, повидон-йод, полигексаметиленбигуанид и октенидин) характеризуются активностью против 72-часовых биопленок P. aeruginosa и снижают микробную обсемененность хронических ран in vitro. Авторы отмечают, что тестируемые ими антисептики активно влияли на начальную фазу образования биопленки P. aeruginosa и при увеличении концентрации действующих веществ снижали количество биопленочных бактерий.

В выполненном нами исследовании протестированы два активных в отношении изученных штаммов антисептика – полигексанид и 3-ГСН. Установлено, что 0,2% раствор полигексанида был значительнее активнее, чем новый антисептик 3-ГСН в концентрации 2,8–3,6 мг/мл как в отношении всей биомассы сформированных 48-часовых биопленок карбапенемазопродуцирующих бактерий, так и против сессильных бактерий. При этом важно отметить, что статистически значимое снижение биомассы микробной биопленки регистрировали уже через 5 минут экспозиции. Ранние исследования также демонстрируют высокую активность растворов на основе полигексанида в эрадикации биопленок P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ортопедической инфекцией [11].

Полученные нами результаты более низкой активности водорастворимого трихелатного комплекса хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетата (3-ГСН) могут быть связанны с менее активным разрушением матрикса биопленок тестируемых штаммов, что не позволило данному антисептику проникнуть внутрь зрелой биопленки.

Заключение

Выполненное исследование показывает чувствительность антибиотикорезистентных штаммов к тестируемым антисептикам, подчеркивает значимость потенциальной антибиопленочной активности раствора полигексонида для клинического использования, особенно в ортопедической хирургии, где профилактика и лечение инфекций, связанных с биопленкой, имеют решающее значение. Сохранение метаболической активности бактерий в составе биопленке подтверждает необходимость тщательной ревизии очага инфекции с удалением пораженных перипротезных тканей и инфицированного имплантата. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на оптимизации времени воздействия антисептического препарата и разработке улучшенных стратегий промывания, обеспечивающих достаточное антибактериальное действие, хорошую цитосовместимость, а также экономическую выгоду с учетом стоимости используемых препаратов.