Раковые стволовые клетки при метастатическом поражении лимфатических узлов у пациентов с колоректальным раком

В настоящее время достигнуты значительные успехи в лечении колоректального рака (КРР) с помощью новых методов таргетной терапии на основе моноклональных антител к коингибирующим белкам иммунной системы [1][2]. Однако у многих пациентов, получивших комплексное лечение, имеет место прогрессирование заболевания и позднее метастазирование. Установлено, что неблагоприятный исход обусловлен наличием раковых стволовых клеток (РСК), резистентных к лекарственной терапии [3]. РСК обладают способностью к самообновлению, имеют неограниченный пролиферативный потенциал и при трансплантации иммунодефицитным мышам способны инициировать рост злокачественной опухоли, обладающей характеристиками исходного новообразования [4]. РСК в первичном очаге опухолевого роста достаточно полно изучены [3]. Значительно менее известно о наличии РСК в регионарных лимфатических узлах у больных раком толстой кишки. Детальное изучение фенотипа РСК в метастатически пораженных лимфоузлах, их иммунобиологических свойств и механизмов взаимодействия с иммунными клетками необходимо для разработки новых методов лечения КРР. Эрадикация всех РСК является ключом к эффективному лечению рака [5].

Цель исследования состояла в изучении содержания РСК с фенотипом EpCAM^highCD44⁺ в метастатических лимфоузлах у больных КРР, а также экспрессию на их поверхности CD133, CD166, CD24 и CD184.

Материалы и методы

Выполнено одномоментное проспективное исследование фенотипа РСК у 123 пациентов с КРР III cтадии, находившихся на лечении в ГУЗ «Краевой онкологический диспансер г. Читы» в период с 2020 по 2025 г. Во всех случаях гистологическая форма злокачественного новообразования представлена аденокарциномой.

Критерии включения: верифицированный колоректальный рак, первичный статус заболевания.

Критерии исключения: лучевая или химиотерапия; аутоиммунные и инфекционные заболевания; воспалительные заболевания толстой кишки.

Контрольную группу составили 87 пациентов, оперированных по поводу неопухолевых заболеваний толстой кишки (пластика колостомы, резекция толстой кишки по поводу дивертикулярной болезни и врожденных аномалий развития) в ГАУЗ «Забайкальская краевая клиническая больница» г. Читы. Основная и контрольная группа сопоставимы по полу и возрасту (p > 0,05).

Исследование выполнено в соответствии приказом МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики» и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации в редакции 2013 г. Исследование прошло экспертизу независимого локального этического комитета ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России (протокол № 98 от 11.11.2019 г.). Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в научном исследовании.

Забор метастатически пораженных лимфатических узлов в основной группе и лимфоузлов брыжейки толстой кишки у пациентов контрольной группы производили во время оперативного вмешательства. Исследуемые ткани доставляли в лабораторию в течение 1 часа в термоконтейнере при температуре 5–10 °C, промывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) и механически измельчали на мелкие фрагменты (2–4 мм). Для получения клеток использовали ферментативный метод. Измельченные образцы гомогенизировали в течение 60 мин при 37 °C в диссоциаторе GentleMACS Dissociator (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) с пробирками С-типа и с использованием набора реагентов Tumor Dissociation Kit (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) согласно инструкции. Полученную суспензию клеток фильтровали через стерильные клеточные фильтры с размером ячеек 70 мкм, центрифугировали при 400 g в течение 7 мин и ресуспендировали в смеси среды DMEM (Gibco, США) и среды HAM’S F12 (Gibco, США), содержащей 50 МЕ/мл пенициллина–стрептомицина и 4 мМ глутамина в соотношении 2:1. Для оценки жизнеспособности клетки окрашивали красителем 7-AAD (Beckman Coulter, США) и затем подсчитывали с помощью оптического фазово-контрастного микроскопа Nikon Eclipse Ci (Германия).

Суспензию клеток опухолевой ткани в объеме 100 мкл окрашивали следующим коктейлем антител Beckman Coulter, США: CD45-Krome Orange (клон J33), CD44-FITC (клон J.173), CD24-PE (клон ALB9); моноклональными антителами BioLegend, Inc., США: CD166-PE/Cyanine7 (клон 3A6), CD184 (CXCR4)-Brilliant Violet 421™ (клон 12G5), CD326 (EpCAM)-Brilliant Violet 650™ (клон QA20A75), CD133-Brilliant Violet 785™ (клон AC133). Инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте, затем образцы промывали дважды стерильным PBS с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich Co., США) (330g в течение 7 мин), ресуспендировали в 300 мкл PBS с 2% нейтральным формалином (кат. HT5011, Sigma-Aldrich Co., Миссури, США) и анализировали методом проточной цитометрии с использованием цитофлуориметра CytoFLEX LX (Beckman Coulter, США). Для обработки полученных результатов применяли программу CytExpert software v.2.0 и Kaluza™ v.2.1.1 (Beckman Coulter, США). Из каждого образца анализировали не менее 50 000 событий. Стратегия гейтирования опухолевых клеток показана на рисунке 1.

Результаты настоящего исследования представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [ Q1; Q3]). С использованием критерия Колмогорова – Смирнова проводили оценку характера распределения значений в вариационном ряду. Для оценки статистической значимости различий показателей группы больных КРР и контрольной группы использовали непараметрический критерий Манна – Уитни (U). Порогом статистически значимых различий считали р < 0,05. Для статистической обработки применяли программу IBM SPSS Statistics Version 25.0 (США).

Результаты исследования

Проводили экспресс-биопсию удаленных метастатически пораженных лимфатических узлов больных КРР III стадии. Лимфоузлы, в которых были обнаружены клетки аденокарциномы, направляли в иммунологическую лабораторию с целью определения состава клеток нелимфоидного происхождения (CD45⁻) в зависимости от экспрессии молекулы адгезии эпителиальных клеток EpCAM и дифференцировочного антигена CD44 (табл. 1).

В общей структуре неиммунных клеток (CD45⁻) в метастатически пораженных лимфатических узлах 23,2 [ 15,4; 30,1]% экспрессируют на своей поверхности молекулу адгезии эпителиальных клеток и 27,2 [ 20,7; 34,4]% одновременно белковые молекулы EpCAM и CD44 (табл. 1). В группе контроля не обнаружено клеток, экспрессирующих на своей поверхности молекулу адгезии эпителиальных клеток EpCAM. В метастатических лимфоузлах выявлено 7,6 [ 4,3; 11,9]% клеток, которые высоко экспрессировали молекулу адгезии и одновременно – дифференцировочный антиген CD44. Нелимфоидных клеток с высокой экспрессией EpCAM в группе контроля также не обнаружено (табл. 1). В лимфатических узлах пациентов, имеющих неопухолевые заболевания, зарегистрирована низкая экспрессия дифференцировочного антигена CD44 клетками нелимфоидного происхождения. Относительное содержание клеток с фенотипом CD45⁻EpCAM⁻CD44⁺ в метастатически пораженных лимфоузлах больных КРР, по сравнению с контролем, значительно возрастало (p < 0,001). Отмечено снижение в 5,8 раза по отношению к группе контроля количества клеток с отрицательной экспрессией как EpCAM, так и CD44 (p < 0,001) (табл. 1).

Результаты проточной цитометрии показали, что у пациентов контрольной группы в регионарных лимфоузлах брыжейки толстой кишки не обнаружено РСК с фенотипом EpCAM^highCD44⁺, экспрессирующих дифференцировочные антигены СD133 и CD166. У больных раком толстой кишки обнаружено 50,8 [ 42,5; 60,1]% клеток, одновременно экспрессирующих СD133 и CD166, и 49,2 [ 39,9; 57,5]% клеток, экспрессирующих дифференцировочный антиген CD133 (табл. 2). Таким образом, выявлена экспрессия CD133 на всех РСК при колоректальном раке.

Результаты фенотипирования показали, что все РСК в метастатически пораженных лимфатических узлах экспрессируют хемокиновый рецептор CXC 4‑го типа (CD184), и 94,9 [ 90,0; 97,7]% из них одновременно экспрессируют CD24 (табл. 3). Таким образом, хемокиновый рецептор CXC 4‑го типа также, как и CD133, является маркером раковых стволовых клеток при КРР.

Обсуждение полученных данных

Специфическими маркерами РСК при КРР являются белковые молекулы, которые экспрессируются на мембране и в цитоплазме опухолевых клеток. В настоящем исследовании изучена экспрессия EpCAM и CD44 на клетках нелимфоидного происхождения метастатических лимфоузлов при КРР. Ранее было доказано, что с помощью двух маркеров EpCAM и CD44 можно идентифицировать РСК при раке толстой кишки. Инъекция мышам NOD/SCID клеток EpCAM^highCD44⁺ вызывает развитие новообразования идентичного исходной опухоли по гистологической и фенотипической характеристике [6]. Опухолевые клетки с высокой экспрессией EpCAM и CD44 обладают большей пролиферативной активностью по сравнению с дифференцированными злокачественными клетками [7].

По нашим данным, содержание РСК с фенотипом CD45-EpCAM^highCD44⁺ в метастатически пораженных регионарных лимфатических узлах больных КРР составило 7,6% в структуре клеток нелимфоидного происхождения. При этом в лимфоузлах пациентов с неопухолевыми заболеваниями толстой кишки мы не идентифицировали клеток, экспрессирующих EpCAM. Таким образом, обнаружение молекулы EpCAM на клетках лимфатических узлов является маркером метастазирования аденокарциномы.

Молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 30–40 кДа, который участвует в адгезии, пролиферации, дифференцировке и миграции клеток, а также в передаче сигналов раковыми и стволовыми клетками [8]. EpCAM экспрессируется на здоровых и злокачественных клетках эпителиального происхождения, в частности при аденокарциноме толстой кишки, молочной железы, желудка, поджелудочной железы и предстательной железы [9].

CD44 является молекулой клеточной адгезии, которая взаимодействует со своим лигандом гиалуроновой кислотой. CD44 участвует в миграции и антигензависимой дифференцировке лимфоцитов, а также экспрессируется в ретикулярных и эндотелиальных клетках лимфатических узлов. CD44-позитивные стромальные клетки лимфатического узла создают микроокружение для иммунных клеток, способствуя их выживанию, дифференцировке и эффективному взаимодействию. В метастатических регионарных лимфоузлах значительно увеличивается количество клеток нелимфоидного происхождения, экспрессирующих CD44, основную популяцию которых составляют собственно злокачественные метастатические клетки, РСК, а также фибробласты и эндотелиальные клетки. Взаимодействие CD44 с гиалуроновой кислотой способствует злокачественным клеткам прикрепляться к строме лимфатического узла. Экспрессия CD44 на эндотелиальных клетках способствует процессам ангиогенеза и прогрессирования опухоли. Данный дифференцировочный антиген рассматривается в качестве маркера РСК при раке молочной железы, поджелудочной железы, немелкоклеточном раке легкого, гепатоцеллюлярном и КРР [10]. Доказано, что после трансплантации CD44-позитивных злокачественных клеток КРР мышам с иммунодефицитом, развиваются опухоли, имеющие морфологические и фенотипические характеристики первичного новообразования [11].

Для более детальной фенотипической характеристики РСК метастатических лимфоузлов нами изучена экспрессия белковых молекул CD133, CD166, CD24 и CD184. Данные белки являются маркерами стволовых опухолевых клеток при разных видах рака и выполняют определенные функции, которые позволяют злокачественным клеткам пролиферировать, самообновляться и метастазировать. Нами установлено, что все РСК метастатических лимфатических узлов при КРР экспрессируют СD133 и 50,8% клеток экспрессируют CD166. Таким образом, белковая молекула CD133 является обязательным маркером стволовых опухолевых клеток КРР. Риччи-Витиани и соавт. [12] доказали способность CD133-позитивных клеток КРР давать начало опухолям у иммунодефицитных мышей после трансплантаций. CD133 (Проминин-1) представляет собой трансмембранный гликопротеин пентаспана, который взаимодействует с холестерином. Данный белок является маркером гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга. Впоследствии он был обнаружен в нормальных тканях человека и на стволовых клетках больных с опухолью головного мозга, гепатоцеллюлярной карциномой, аденокарциномой легких, предстательной железы, толстого кишечника [13]. Повышенный уровень экспрессии CD133 имеет корреляционную связь с неблагоприятным прогнозом при КРР и резистентностью к химиотерапии [14].

Наибольший интерес представляют полученные нами данные, свидетельствующие о том, что все РСК в регионарных метастатических лимфоузлах экспрессируют CD184. Последний представляет собой хемокиновый рецептор CXC типа 4 (CXCR-4). Лигандом данного белка является стромальный фактор-1 (SDF-1, CXCL12), обладающий выраженной хемотаксической активностью в отношении лимфоцитов [15]. В здоровых тканях наблюдается очень низкая экспрессия CD184. Мы полагаем, что высокая экспрессия хемокинового рецептора на поверхности РСК является неблагоприятным фактором, который во многом способствует лимфогенному метастазированию КРР. Клетки аденокарциномы с высокой экспрессией CD184 становятся более инвазивными и способны проникать в регионарные лимфатические узлы благодаря градиенту CXCL12. Экспрессия CD184 на РСК при колоректальном раке это классический пример того, как злокачественные клетки используют нормальные физиологические процессы для своего функционирования. Наше предположение подтверждается литературными данными, свидетельствующими о том, что при высокой экспрессии данного хемокина наблюдаются метастазы опухоли и плохой прогноз для пациента [15]. В связи с этим данный белок может рассматривается в качестве потенциальной терапевтической мишени в лечении злокачественных опухолей.

Таким образом, РСК в метастатических лимфоузлах больных КРР имеют фенотип: CD45⁻EpCAM^highCD44⁺CD133⁺CD184⁺. РСК следует рассматривать в качестве перспективных мишеней в стратегии иммунотерапии больных раком толстой кишки.

Заключение

В метастатически пораженных регионарных лимфатических узлах больных раком толстой кишки III стадии РСК, высокоэкспрессирующие молекулу адгезии EpCAM и дифференцировочный белок CD44, составляют 7,6% от клеток нелимфоидного происхождения. Хемокиновый рецептор CXC 4‑го типа (CD184) так же, как и трансмембранный гликопротеин Проминин-1 (CD133), определяется на всех РСК метастатических лимфоузлов при КРР. Полученные нами данные о составе и фенотипической характеристике РСК в метастатически пораженных лимфатических узлах создают основу для разработки новых методов иммунотерапии КРР.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: работа выполнена при финансовой поддержке ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава РФ в рамках утвержденного плана НИР.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – ВВК, ВЛЦ, ППТ

Сбор и обработка материала – ВВК, ВЛЦ, ППТ

Статистическая обработка – ВВК

Написание текста – ВВК, ВЛЦ, ППТ

Редактирование – ВЛЦ