Поиск потенциальных анксиолитиков среди селективных ингибиторов карбоангидразы II типа

Современный мир характеризуются высоким уровнем политических и военных конфликтов, дестабилизацией экономической обстановки и ухудшением уровня жизни людей, повышением экстремистской деятельности и преступности, наличием пандемии (например, COVID-19 в 2020 г.), повлекшей за собой карантинные мероприятия, – все это отражается на психологическом здоровье людей, вызывая резкое повышение психоэмоциональных расстройств в большинстве стран мира [1][2]. Наиболее частыми психоэмоциональными расстройствами являются тревожные расстройства. Сама по себе тревога – это ответная реакция организма, возникающая на угрозы, поступающие из окружающей среды [3]. Однако тревога может проявляться чрезмерно, переходя из физиологической в патологическую, которая и лежит в основе развития тревожных расстройств. По данным ВОЗ, именно тревожные расстройства могут стать одной из причин инвалидности [4].

Эпидемиология тревожных расстройств (ТР) обширна: около 4% населения Земли (около 300 млн человек) страдают клинически выраженной тревогой. При этом только в России выявлено 4,9 млн человек, страдающих тревожными расстройствами, причем примерно треть из них страдает тревожно-депрессивным расстройством [5].

В настоящее время в мире и в нашей стране одним из распространенных тревожных расстройств является посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) [6].

Существуют два основных метода лечения ТР – психо- и фармакотерапия, причем второй метод является и наиболее простым в применении и наиболее экономически выгодным. Селективным методом лечения тревожных расстройств являются транквилизаторы, так как все они обладают клинически выраженным анксиолитическим эффектом. Основной терапевтической группой являются бензодиазепиновые транквилизаторы. Однако, несмотря на наличие выраженного анксиолитического и вегетостабилизирующего эффекта, прием бензодиазепиновых транквилизаторов имеет многочисленные побочные эффекты [7][8]. Это снижение когнитивных функций (внимания, памяти, интеллекта), появление миорелаксации и сонливости, половые дисфункции, наличие синдрома отмены и появление зависимости. Возможно проявление антеградной амнезии у людей пожилого возраста.

Поскольку механизм формирования основных групп побочных эффектов при использовании бензодиазепиновых транквилизаторов связан со сверхактивацией ГАМК-системы, то важен поиск анксиолитиков с иным механизмом анксиолитического действия [9].

Цель исследования: поиск новых анксиолитиков среди селективных ингибиторов карбоангидразы II типа.

Материалы и методы

Материалами исследования являются 9 новых селективных ингибиторов карбоангидразы II типа (ИКАII) – производные сульфонамидов с лабораторными шифрами В1–3, В10–13, В18, В24. Сотрудниками отдела химической разработки ЦТФТ им. М.В. Дорогова нам были предоставлены данные об селективности исследуемых веществ относительно некоторых изоформ карбоангидразы (табл. 1).

Всего в экспериментах были использованы 181 мышь линии ICR (CD-1) массой 30–40 г и 119 крыс линии Wistar массой 210–350 г. (питомник ООО «СТЕЗАР»). Животные были распределены на две группы: контроль и опыт, по 6 особей для крыс и по 10 особей для мышей. В качестве контроля во всех видах опытов использовался натрия хлорид – СОЛОфарм 0,9%. Животные содержались при температуре 22 ±2 °C, влажности 55 ± 5% и 12/12-часовом световом цикле, со свободным доступом к пище и воде. Исследование на животных одобрено независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол № 69 от 13.09.2024 г. Поведенческие реакции (анксиолитическую, антидепресивную, локомоторную, когнитивную активность и эмоциональную реактивность) исследовали на моделях при помощи методик «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Подвешивание за хвост». Установки для изучения поведенческих реакций были приобретены у ООО «НПК Открытая Наука». Соединения вводили внутрибрюшинно за 30 минут до эксперимента в дозе 10 мг/кг.

Методика «Открытое поле» позволяет выявить действие препарата на ориентировочную, двигательную, исследовательскую активность; используется и для выявления анксиолитического действия препаратов (проявляется в устранении страхов у грызунов, что увеличивает их двигательную активность). Наблюдение за животными проводилось 5 минут. Регистрировали следующие параметры: горизонтальную активность (количество секторов, пересеченных животным), вертикальную активность (количество подъемов на задние лапы с опорой на стенку или без нее), исследовательскую активность (количество заглядываний в «норки»), эмоционально-поведенческую активность – груминг (количество облизывания лап и чистка передней части морды и тела) и эмоциональную реактивность (количество экскрементов).

Методика «Приподнятый крестообразный лабиринт» основана на естественном избегании открытых и светлых участков, а также боязни падений с высоты у грызунов. Данный метод позволяет выявить анксиолитическое действие препарата, которое проявляется в виде увеличения числа заходов, свешиваний и времени нахождения в открытых рукавах лабиринта. Количество заходов в рукава используется как показатель общей моторной активности. В течение 5 минут регистрировались следующие параметры: время пребывания в рукавах, количество стоек в открытых и закрытых рукавах и количество свешиваний в открытых рукавах [10].

Методику «Подвешивание за хвост» используют для выявления действия антидепрессантов. В этом тесте фиксируют время иммобилизации и активности у мышей, которые подвергаются кратковременному неизбегательному стрессу. Общее время тестирования составляет 6 минут для каждой мыши. За период тестирования отмечают начало иммобилизации, ее продолжительность и время активности животного, которое делает попытки побега. Маятникообразные движения висящей мыши не засчитываются как время активности [11].

Полученные результаты подвергались статистической обработке при помощи программы БИОСТАТИСТИКА. Количество определений каждого показателя в различных опытах составляло 6–10. Для межгрупповых сравнений использовался критерий t Стьюдента (при наличии нормального распределения) и непараметрический критерий Уилкоксона (при его отсутствии), для множественных сравнений использовался критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Достоверность внутригрупповых различий определялась по парному критерию t Стьюдента. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования

Исследования «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» проходили на двух видах животных: мыши и крысы. Сопоставление результатов, полученных у мышей и крыс, позволяет более объективно оценить фармакологическую активность изучаемых препаратов.

Анализ полученных данных у мышей (табл. 2) показал, что препараты В1, В2 и В3 достоверно снижали локомоторную активность животных. Вещество В1 снижало локомоторную активность на 55,6%, В2 – на 66,1% и В3 – на 44,8%. Вертикальная активность снижалась более существенно: В1 – на 94,8%, В2 – на 99,2% и В3 – на 76,2%. Также при введении В2 снижалась исследовательская активность почти в 2 раза, а использование В3 повышало эмоциональную реактивность в 3,4 раза. Также следует отметить достоверное повышение исследовательской активности на 63,3 и 55,0% при введении В 18 и В10 соответственно. Также при использовании В24 имело место повышение эмоциональной реактивности. Тенденцией к увеличению горизонтальной активности обладали В12 и В13, а при введении В18 наблюдалась тенденция к увеличению и вертикальной и горизонтальной активности. В11 и В24 имели тенденцию к увеличению исследовательской активности.

У крыс при использовании теста «Открытое поле» (табл. 3) имело место достоверное повышение локомоторной активности на фоне введения В12 и В24 (увеличение горизонтальной активности в 2 и 1,8 раза), причем В24 способствовал повышению и горизонтальной активности в 2,5 раза. Короткий груминг (антистрессорное поведение) при использовании В3 и В24 возрастал в 1,9 и в 2,5 раза; исследовательскую активность (когнитивные функции) повышали В1 (+79,1%) и В24 (+109,3%).

Следующей методикой определения анксиолитической активности исследуемых препаратов у животных был «Крестообразный лабиринт», наиболее важными параметрами которой являются время пребывания в открытых рукавах лабиринта и количество стоек там же, а также количество свешиваний.

Анализ таблицы 4 показал, что введение В24 мышам достоверно в 3 раза повышало продолжительность пребывания мышей в открытых рукавах и в 9,5 раз достоверно увеличивало количество свешиваний по отношению к контролю; количество стоек в открытых рукавах лабиринта также увеличивалось в 7,5 раза, но имело характер тенденции. Время пребывания в открытых рукавах достоверно в 1,4 раза повышало соединение В10. В остальных случаях наблюдалась лишь тенденция к положительным результатам: В2 – продолжительность пребывания в открытых рукавах и количеством свешиваний; В3 и В10 – количество свешиваний.

Анализ данных таблицы 5 показал, что у крыс значимой анксиолитической активности обладает В24, которое в 3,5 раза повышает продолжительность нахождения в открытых рукавах и в 6,5 раза – количество свешиваний; имеет место тенденция (2,4 раза) к повышению стоек в открытых рукавах. Значимой анксиолитической активностью обладает также В1, который почти в 4 раза повышает время нахождения в открытых рукавах и в 7,5 – количество свешиваний. При введении В2 и В10 имеет место тенденция к продолжительности нахождения в открытых рукавах и количестве свешиваний.

Тест «Подвешивание за хвост» позволяет предположить у изучаемых веществ антидепрессивное действие. Из таблицы 6 видно, что латентный период иммобилизации достоверно повышает в 2,1 раза соединение В13. У соединений В12, В11 и В24 имеет место лишь тенденция на 60–80% к увеличению данного показателя. Общее время иммобилизации достоверно снижает только В24 (на 56,4%), а соединение В18, наоборот, удлиняет продолжительность иммобилизации на 82,8%. Аналогично предыдущему показателю, только В24 повышает общее время активности на 20,5%. В то же время В18 его снижает на 30,3%.

Обсуждение полученных данных

Как известно, карбоангидраза прежде всего катализирует синтез и распад угольной кислоты, являясь важным фактором регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме. Всего у человека описано 15 изоформ фермента, из которых карбоангидраза II типа (КА II) наиболее широко распространена в головном мозге. У человека она экспрессируется в олигодендроцитах, миелинизированных трактах, астроцитах и миелиновых оболочках мозга [12]. Имеются литературные данные, что в экспериментах на животных ингибиторы КА II обладают клинически значимым анксиолитическим эффектом, способствуя нормализации у них поведенческих реакций при тяжелом эмоциональном стрессе. Таким образом, эти данные указывают, что селективные ингибиторы КА II могут быть перспективными соединениями для разработки нового класса транквилизаторов, имеющих иной механизм действия и более благоприятный профиль безопасности, чем бензодиазепиновые транквилизаторы.

Поскольку у крыс и мышей существует межвидовая разница в однотипных поведенческих реакциях, то для более объективной оценки полученных данных эксперименты проводились на обоих видах лабораторных животных.

Методика «Открытое поле» – одна из наиболее распространенных при изучении поведения у животных. В наших экспериментах, прежде всего, она показала, что имели место существенные различия в полученных результатах у мышей и крыс. Так, у  крыс, в отличие от мышей, не наблюдалось угнетающего действия (выраженное снижение локомоторной активности и исследовательского поведения) при введении веществ В1, В2 и В3. Более того, у веществ В12 и В24 (в отличие от мышей) достоверно повышалась локомоторная активность. Снижение локомоторной активности можно трактовать как повышение уровня тревожности у животных [13]. В то же время ее активация является проявлением адаптивного поведения животных в условиях незнакомой обстановки (аналог анксиолитического действия). Повышение короткого груминга крыс на фоне применения В3 и у В24 является выражением антистрессового поведения. И если у мышей повышение исследовательской активности при введении В24 имело вид тенденции, то у крыс были получены достоверные результаты.

На основании полученных результатов на обеих видах животных можно сделать заключение, что в методике «Открытое поле» В24 обладает наибольшей анксиолитической активностью среди изученных препаратов и одновременно способно повышать когнитивные функции. За ним следует соединение В12 (достоверное повышение локомоторной активности и тенденция к повешения исследовательской активности у крыс) и В18 (тенденция локомоторной активности и достоверное повышение исследовательской активности у мышей). Соединения В1, В2 и В3 на мышах обладали анксиогенной активностью, причем на фоне введения В2 достоверно снижалась исследовательская активность и имела место тенденция к снижению короткого груминга.

Крестообразный лабиринт является основной методикой выявления анксиолитического действия. Сопоставляя данные, полученные у мышей и крыс, можно отметить, что выраженной анксиолитической активностью и в том, и в другом случае обладает только В24 [14]. Далее по убывающей активности следует В10, который достоверно увеличивает время пребывания в открытых рукавах у мышей и в виде тенденции – у крыс. Также данное соединение и у крыс, и у мышей в виде тенденции повышает количество свешиваний. В1 только у крыс достоверно повышает время пребывания в открытой части лабиринта и количество свешиваний. В2 в виде тенденции и у крыс, и у мышей повышает время пребывания в открытых рукавах и количество свешиваний.

Исследование антидепрессивной активности у селективных ингибиторов КА показало, что ее наличие можно предположить только у соединения В24 и нельзя исключить его наличия у соединения В13. В то же время соединение В18 усугубляет депрессивное состояние у животных.

Обобщая полученные данные, то можно составить следующий ряд анксиолитической активности у исследуемых веществ: В24 (+антидепрессивный эффект) >> В10 ≥ В12 > В18 (вероятность усиления депрессии).

Заключение

В данных экспериментах выявлено, что соединение В24 и на крысах, и на мышах обладает анксиолитической и антидепрессивной активностью, а также повышает когнитивные функции животных. Также потенциально анксиолитическим действием обладает соединение В10, В12 и В18, а антидепрессивной активностью – В13.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: научное исследование выполнено за счет гранта в форме субсидий (соглашение № 25НП/2024).

Участие авторов:

Проведение эксперимента, первичный анализ полученных данных – ЛОЭ

Разработка концепции и дизайна исследования – ФВН

Анализ литературы и оформление списка литературы, написание введения – ШАА

Синтез исследуемых соединений – САВ

Работа с рукописью и проверка критически важного интеллектуального содержания – ССШ