Оптимизация метода Фолина – Чокальтеу для определения фенольных антиоксидантов в побегах боярышника перистонадрезанного (Crataegus pinnatifida)

Природные (поли)фенольные соединения (ФС) – наи-более распространенный класс вторичных метаболитов в царстве растений. Структурно класс фенолов представляют флавоноиды, фенольные кислоты, дубильные вещества, гидроксикоричные кислоты, проантоцианидины, стильбены, лигнаны, кумарины и другие группы.

В значительной степени положительное влияние ФС на организм человека сводится к антиоксидантному эффекту. Многие исследования доказали взаимосвязь между содержанием ФС и антиоксидантной активностью растений, что является основанием для использования растительных препаратов с высоким содержанием ФС как потенциальных средств для профилактики и лечения заболеваний, в патогенетическом механизме которых лежит окислительный стресс [1][2]. Следует заметить, что эта группа вторичных метаболитов может предотвращать развитие ряда заболеваний человека и с помощью других механизмов, отличных от антиоксидантной функции. В литературе описана роль ФС в модуляции ферментативной активности и сигнальных путей клеточной передачи, влияние ФС на экспрессию генов, воздействие на транскрипционные факторы и другие механизмы [3–5]. Имеются убедительные доказательства, которые демонстрируют многофункциональную роль ФС в терапии и профилактики сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, эндокринных, инфекционных, воспалительных заболеваний, онкологических, а также заболеваний, связанных с нарушением метаболизма [3–8].

Особый интерес для медицины в качестве источника антиоксидантов, преимущественно фенольных, может представлять Боярышник перистонадрезанный (Crataegus pinnatifida) – представитель фитоценозов российского Дальнего Востока [9], не имеющий на сегодня официального статуса. Оценка количества фенольных антиоксидантов в данном виде боярышника может быть очень информативной в перспективе обоснования использования побегов боярышника перистонадрезанного в медицинской практике.

Для определения общего содержания ФС в растительных экстрактах в исследованиях наиболее широко применяется спектрофотометрический метод с использованием реактивов Фолина – Дениса (ФД) и Фолина – Чокальтеу (ФЧ). Фенольный комплекс боярышника перистонадрезанного представлен в значительной степени полимерными ФС – процианидинами, для окисления которых необходимо достаточно высокое значение рН [10]. Использование реактива ФД в щелочных средах приводит к образованию белого осадка [11][12]. В результате снижаются чувствительность и воспроизводимость методики, что подтверждают предварительные скрининговые пробы. Напротив, реактив ФЧ позволяет работать в области высоких значений рН, так как для предотвращения образования осадка в данный реактив внесен сульфат лития.

В настоящее время используются разные модификации метода ФЧ, связанные с условиями приготовления экстракта и проведения реакции. Важной деталью при проведении реакции ФЧ, которую нельзя игнорировать, является рН реакционной смеси, создаваемая чаще всего добавлением раствора натрия карбоната.

Различные методологические подходы реализации метода ФЧ объясняются многокомпонентным неоднородным составом фенольного комплекса, индивидуальным для конкретного растительного объекта [13–15].

Цель данного исследования состояла в оптимизации метода ФЧ для определения фенольных антиоксидантов в побегах боярышника перистонадрезанного (Crataegus pinnatifida) с привлечением методологии поверхностного отклика и плана Бокса – Бенкена.

Побеги боярышника перистонадрезанного заготавливали в фазу начала цветения в естественной природной популяции Хабаровского края (п. Николаевка, Смидовичский район, Еврейская автономная область). Сушку сырья проводили воздушно-теневым способом в хорошо проветриваемом помещении. Далее аналитическую пробу сырья измельчали до величины частиц, проходящих сквозь сито с размером отверстий 1 мм.

Для разработки методики точные навески измельченного сырья в соответствии с соотношением к объему экстрагента от 1:100 до 1:900 помещали в колбы со шлифом вместимостью 50 мл. Прибавляли по 50 мл спирта этилового определенной концентрации (40, 50, 60, 70 и 80%), закрывали пробкой и взвешивали с погрешностью ± 0,01 г. Колбы присоединяли к системе обратных холодильников и нагревали на кипящей водяной бане в течение определенного в эксперименте времени (15, 30, 45, 60 и 90 мин). Затем колбы охлаждали до комнатной температуры и доводили до первоначальной массы спиртом этиловым соответствующей концентрации. Извлечение фильтровали через обеззоленный фильтр (красная лента), отбрасывали первые 10 мл фильтрата. Аликвоты (рассчитывались для каждой анализируемой пробы в зависимости от используемого соотношения сырья к объему экстрагента) полученных экстрактов помещали в мерные колбы со шлифом вместимостью 10 мл, прибавляли 2 Н раствор реактива ФЧ (1, 2, 3, 4 и 5 мл) и 2,0 мл дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивали и через 3 минуты добавляли 20% раствор натрия карбоната (1, 2, 3, 4 и 5 мл). Полученную смесь доводили водой до метки, перемешивали и при комнатной температуре выдерживали определенное в эксперименте время. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 760 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Для приготовления растворов сравнения в мерные колбы со шлифом вместимостью 10 мл помещали вместо экстрактов чистый экстрагент, соотношение реактива ФЧ и 20% раствора натрия карбоната соответствовали анализируемой пробе.

Содержание суммы ФС в пересчете на кислоту галловую в сухом сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:

где С – массовая концентрация фенольных соединений в исследуемом растворе, найденная по градуировочному графику кислоты галловой, мг/мл; а – навеска сырья, г; W1, W2 – объемы мерных колб, мл; V_a – объем аликвоты, мл; W – влажность сырья, %; 1000 – коэффициент пересчета для получения конечного результата ФС в процентах.

Построение калибровочного графика кислоты галловой осуществляли с использованием растворов кислоты галловой, соблюдая порядок и условия добавления реактивов аналогичные испытуемым пробам. В диапазоне концентраций кислоты галловой от 0,001 до 0,006 мг/мл калибровочная кривая имеет выраженную линейность, коэффициент корреляции составил 0,9997, что позволяет использовать данный график для расчетов (рис. 1).

Для разработки и оптимизации методики определения фенольных антиоксидантов применительно к исследуемому объекту в работе была использована методология поверхностного отклика и план Бокса – Бенкена как наиболее часто используемая конструкция планов эксперимента. Данный инструмент позволяет оценить эффекты различных факторов и их взаимодействия, влияющих на точность и воспроизводимость анализа и рассчитать их оптимальные значения с минимальным количеством экспериментальных испытаний [16].

Для измерения оптической плотности использовали спектрофотометр UV-1700, Shimadzu (Япония). Каждый опыт в эксперименте повторяли трижды. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ XV издания ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний» с помощью пакетов прикладных компьютерных программ Microsoft Office Excel 2010 и Statistica 6.0.

Задачей первого этапа исследований явилось определение оптимальных параметров реакции (рН, количества реактива ФЧ), влияющих на точность, воспроизводимость, стабильность продуктов реакции, а также на кинетику реакции [12]. Для этого был приготовлен ряд испытуемых смесей с различными значениями рН и соотношениями реактивов ФЧ и 20% раствора натрия карбоната и измерена их оптическая плотность.

Установлено, что максимальное значение оптической плотности наблюдается при рН в диапазоне 9,4–10,2. Оптимальный интервал рН для проведения реакции окисления обеспечивается соотношением реактива ФЧ и 20% раствором натрия карбоната 1:(8–10) соответственно. При этом 0,4–0,7 мл реактива ФЧ является достаточным для максимального выхода продуктов реакции. Далее в эксперименте использовали 0,5 мл реактива ФЧ и 5 мл 20% раствора натрия карбоната. В выбранных оптимальных условиях реакция окисления достигает плато поглощения на 15‑й минуте. Раствор остается стабилен как минимум 90 минут. Поэтому в качестве аналитического времени было выбрано время реакции 30 минут.

Следующим этапом для достижения цели оптимизации методики определения фенольных антиоксидантов являлся выбор независимых факторов, объективно влияющих на эффективность экстракции ФС из побегов боярышника перистонадрезанного. Скрининговые предварительные исследования показали, что концентрация спирта этилового (Х₁), время экстракции (Х₂) и соотношение массы сырья к объему экстрагента (Х₃) существенно влияют на выход окисляемых фенольных соединений из побегов боярышника перистонадрезанного. Для модели плана Бокса – Бенкена диапазон каждого независимого фактора экстракции определяли с помощью серии однофакторных экспериментов. В каждом эксперименте изменяли один независимый фактор экстракции, при этом все остальные оставались постоянными (рис. 2).

Однофакторный экспериментальный анализ показал, что общий выход ФС из сырья достигается при использовании 60% спирта этилового, дальнейшее снижение полярности растворителя уменьшает выход исследуемой группы веществ (рис. 2а). Стабилизация выхода ФС фиксировалась на 60‑й минуте, далее количество ФС начало уменьшаться, что связано, вероятно, с длительным воздействием температурного фактора (рис. 2б). Применительно к исследуемому объекту видно, что на процесс экстракции существенно влияет соотношение массы сырья к объему экстрагента (рис. 2в). Увеличение объема растворителя позволяет увеличить площадь поверхности раздела между двумя фазами экстракции – экстрагента и растительного сырья, что, по-видимому, является определяющим фактором экстракции этой группы веществ, объединяющей различные по структурам фенолы.

На основании однофакторного эксперимента для дальнейшей оптимизации методики были определены независимые факторы экстракции, их интервалы и составлен план Бокса – Бенкена. Матрица плана Бокса – Бенкена (15 точек, включая 3 центральных) с кодированными и фактическими значениями уровней независимых факторов экстракции представлена в таблице 1. Эффективность извлечения ФС оценивали по экспериментальному отклику (Y_эксп.) – количеству ФС в процентах в сухом сырье боярышника перистонадрезанного.

Проведенные в соответствии с планом Бокса – Бенкена эксперименты (табл.) позволили вывести полиномиальное регрессионное уравнение второго порядка, описывающее взаимодействия между тремя независимыми факторами экстракции и экспериментальным откликом. Общее уравнение модели, которое иллюстрирует поведение комбинаций независимых факторов в пределах диапазона, заданного дизайном эксперимента, имеет вид:

Y_расч = 8,5156 – 0,3654X₁ + 0,1354X₂ – 0,1842X₃ – 0,0325(X₁X₃) + 0,0575(X₂X₃) – 0,3453(X₁)² – 0,2903(X₂)² – 0,2294(X₃)²,

где Y_расч – рассчитанный отклик, связанный с комбинацией независимых факторов; 8,5156 – свободный член уравнения; X_n – регрессионные коэффициенты линейных факторных эффектов; X_nm – регрессионные коэффициенты эффектов взаимодействия между факторами; (X_n)² – регрессионные коэффициенты квадратичных факторных эффектов.

Все независимые факторы экстракции являются значимыми.

Для оценки эффективности соответствия математической модели было проведено сравнение экспериментальных откликов (Y_эксп) с прогнозируемыми (Y_расч). Последние были получены с помощью полиномиального регрессионного уравнения модели второго порядка. Высокий коэффициент детерминации (R² = 0,9897) показал, что математическая модель адекватна, экспериментальные и расчетные отклики хорошо коррелируют между собой (рис. 3).

Графические 3D-модели поверхностей отклика отражают влияние исследуемых независимых факторов экстракции на выход ФС из побегов боярышника перистонадрезанного (рис. 4).

Полученные параметры независимых факторов, описывающие оптимальные условия экстракции фенольных антиоксидантов из побегов боярышника перистонадрезанного, следующие: концентрация спирта этилового – 54,87%; время экстракции – 65,99 мин; соотношение массы сырья к объему экстрагента – 1:783. При этих параметрах экстракции прогнозируемое количество суммы фенольных антиоксидантов составило 8,65%; среднее значение в условиях эксперимента составило 8,71 ± 0,06%. Установлено, что увеличение кратности экстракции не влияет на выход целевой группы веществ.

Применительно к побегам боярышника перистонадрезанного определены оптимальные параметры реакции ФЧ – 0,5 мл реактива ФЧ и 5 мл 20% раствора натрия карбоната, обеспечивающие точность, воспроизводимость и стабильность продуктов реакции.

Методология поверхностного отклика и план Бокса – Бенкена позволили провести оценку одновременного влияния трех независимых факторов на экстракцию ФС из побегов боярышника перистонадрезанного. В результате были достигнуты оптимальные условия максимального выхода фенольных антиоксидантов из сырья боярышника перистонадрезанного.

На основе полученных данных разработана методика количественного спектрофотометрического определения ФС в побегах боярышника перистонадрезанного, которая будет использована в решении ряда вопросов, связанных со стандартизацией данного вида сырья.

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования: научное исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания по теме «Изучение перспективных фитокомплексов из лекарственных растений Дальнего Востока и разработка на их основе биологически активных добавок и лекарственных средств».

Участие авторов:

Разработка концепции и дизайна – МГЯ, МНВ, СЕВ

Сбор и обработка материала – МГЯ, МНВ, СЕВ

Статистическая обработка – МГЯ, МНВ

Анализ и интерпретация данных – МГЯ, МНВ, СЕВ

Написание текста – МГЯ, МНВ

Утверждение окончательного варианта рукописи – МГЯ, МНВ