Фармакологические мишени стволовых клеток глиобластомы

Глиобластома – смертоносная опухоль мозга, практически резистентная к лечению. Медиана выживаемости больных – 15 мес. [1]. Резистентность к лечению связана [2] с опухолевыми стволовыми клетками (ОСК). Облучение и цитостатики не способны уничтожать клетки этого типа [3] в организме больного, что диктует необходимость поиска фармакологических мишеней для повышения эффективности химиолучевой терапии, что является целью данной работы и актуальной проблемой молекулярной онкологии.

Высокая пластичность является главной характеристикой ГБ, при этом свойства ОСК могут проявлять как опухолевые клетки (ОК), экспрессирующие на мембране ключевой маркер ОСК – антиген CD133, так и клетки, лишенные данного маркера. В связи с этим для достижения поставленной цели выполнено сравнительное транскриптомное исследование CD133⁺ и CD133 – клеток ГБ с последующим биоинформационным анализом наблюдаемых изменений.

Материалы и методы

Исследование одобрено Этическим комитетом Школы биомедицины ДВФУ (протокол № 2 от 28.11.2018 г.). Для транскриптомного и протеомного анализа использованы реагенты: ацетонитрил (Prolabo), муравьиная кислота (F0507), мочевина (U5378), бикарбонат аммония (BioUltra, 09830), дитиотреитол (43815, BioUltra), йодацетамид (I1149), 2,2,2-три-фторэтанол (T63002, Reagent Plus), уксусная кислота (A6283 Reagent Plus), соляная кислота (BioReagent, H1758). Смесь ингибиторов протеазы (P8340), набор для лизиса клеток млекопитающих (MCL1), фосфатно-солевой буфер (PBS, P5493), трипсин (протеомный класс, T7575), трихлорэтилфосфат (TCEP, 07296), трифторуксусные кислоты для анализа белковых последовательностей (TFA, 299537) – компании Merck. Сверхчистую воду получали, используя систему очистки воды Milli-Q® CLX 7000 (Millipore). RNeasy Mini Kit (Qiagen), Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent), Agilent RNA Pico 6000 Kit (Agilent), GeneChip™ Human Gene 2.0 ST Array (Applied Biosystems™), GeneChip™ Hybridization, Wash, and Stain Kit (Applied Biosystems™, 900720). Все реагенты и материалы производства США.

В работе использованы клетки ГБ линии U-87 MG (ATCC® – HTB-14) – IDH-wild type ГБ человека. Линия получена из Американской коллекции клеточных культур (ATCC) и предоставлена профессором университета Уппсалы Hari Sharma. Характеристики культуры соответствуют паспортным параметрам и подтверждены сертификатами соответствия ISO 9001, ISO 13485, ISO/IEC 17025 и ISO 17034. Клетки протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30-1012K™).

Клетки культивировали при стандартных условиях (t 37 ºC, 5% CO₂) в 6-луночных планшетах со средой «Dulbecco's Modified Eagle Medium» (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) с пенициллином/стрептомицином (100 Ед/мл, антибиотика-антимикотика 100X до достижения 80% конфлюэнтности монослоя. Адгезировавшие ОК снимали с помощью ферментативной диссоциации (0,05% trypsin-EDTA, 1:4 при 37 ºС, 10 мин.) и центрифугировали (120 g, 4 мин.), сливали надосадочную жидкость, добавляли свежей среды, ресуспендировали и использовали после 3-го пассажа. Все реагенты производства Gibco (США).

Получение ОСК проводили при культивировали ОК линии U87 MG во флаконах Т75 при 37 °С, в атмосфере 5% CO₂, в среде «DMEM/F12» с пониженным содержанием сыворотки и добавлением L-глютамина; B27; FGF-β, 20 нг/мл; EGF, 20 нг/мл; пенициллина/стрептомицина по 100 Ед/мл; гепарина (5 мкг/мл). Реагенты производства Gibco (США). Добавление свежих ростовых факторов проводили каждые 3 дня. Для селекции ОСК использовали иммуносортинг на магнитных шариках, покрытых иммобилизованными на них антителами к антигену CD133 (130-105-226; Miltenyi Biotec, Inc.).

Транскриптомный анализ. Выделение тотальной РНК, процессирование, амплификацию и мечение образцов проводили в соответствии с инструкцией компании-производителя (протокол GeneChip WT PLUS) и гибридизовали в печи GeneChip 640. Промывку и сканирование проводили с использованием системы GeneChip (Affymetrix, США), используя программное обеспечение Affymetrix GCOS. Данные обрабатывали, используя программы AffymetrixR DataMining Tool 3.0 (Affimetrix, США), DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery; https://david.ncifcrf.gov).

Биоинформационный анализ молекулярных функций генов и белков, их роль в биологических процессах аннотированы с использованием баз данных «PubMed», «PANTHER» (https://www.pantherdb.org), «Gene Ontology» (http://www.geneontology.org), «KEGG» (https://www.genome.jp/kegg/) и «STRING v10» (https://string-db.org/), The Cancer Genome Atlas Program «TCGA».

Результаты

Сравнительная транскриптомная характеристика CD133 (+) и CD133 (-) клеток ГБ линии U87MG

Среди 21 100 идентифицированных генов статистически значимые изменения экспрессии (p < 0,05) были характерны для 1805 дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ), среди которых выявлено 677 генов, экспрессия которых в CD133(+) ОСК была в 2 и более раз выше по сравнению с CD133(-) ОК. ПО данным базы данных онтологии генов (GO) и сигнальных путей (KEGG) установлена принадлежность этих генов к жизненным процессам ОСК (рис.).

Самое большее число ДЭГ относились к кластеру сигнальной трансдукции – 350 генов, а также к ключевым жизненным процессам ОСК: клеточной адгезии – 92, апоптозу – 78, иммуносупрессии – 50, деления клеток – 54, миграции клеток – 53 (рис. А). Результаты KEGG-анализа показали, что наибольшее число ДЭГ обогащены в онкогенных сигнальных каскадах, внутриклеточных сигнальных путях PI3K-Akt; Wnt-25, молекул клеточной адгезии и обмена кальция (рис. Б). Результаты биоинформационного анализа с использованием программы DAVID показали, экспрессия 13 ДЭГ в CD133(+) ОСК была 4 и более раз выше, чем СD133(-) ОК (табл.), что позволяет считать их особо важными фармакологическими целями.

Обсуждение полученных результатов

Из 21 100 генов, идентифицированных на основании соответствующих уровней мРНК, дифференциально экспрессированными были только 1805 (8,5%), из которых экспрессия только 679 генов была более чем в 2 раза выше в ОСК по сравнению с ДОК. Результаты KEGG-анализа показали, что 350 из этих ДЭГ (51,5% от 679) были обогащены в кластере генов-посредников внутриклеточной сигнальной трансдукции, что характеризует ОСК как особо открытую систему для взаимодействия с микроокружением, свидетельствует о большой пластичности ОСК и наличии особых механизмов для реализации ее пролиферативного потенциала. Не менее важно, что 25 ДЭГ в ОСК ассоциированы с сигнальным каскадом кальция, что в связке с иммуносупрессией обеспечивает подавление локального воспаления и препятствует построению фиброзной капсулы, способной инкапсулировать хронифицирующийся флогогенный очаг. Еще более важно, что 53 ДЭГ связаны с процессами миграции, а в совокупности 92 гена клеточной адгезии и 26 генов молекул клеточной адгезии регулируют механизмы взаимодействия с ВКМ. В этом контексте заслуживает особого внимания наличие 54 ДЭГ, ассоциированных с процессом пролиферации, 19 ДЭГ сигнальных путей PI3K-AKT и 25 ДЭГ сигнального пути Wnt; вместе это комплекс ДЭГ, напрямую связанных с реализацией плюрипотентных свойств и пролиферативной активностью СКГ [4], что требует первоочередного внимания.

Особый интерес представляют ДЭГ, уровень синтеза которых усилен в ОСК в 8 раз. Выявлены три особо важные цели – akt1, hdac1 и ctnnb1. Центральным из идентифицированных ДЭГ является ctnnb1/β-катенин – важнейший компонент канонического сигнального пути Wnt [5], что сближает ОСК с нормальными стволовыми клетками. В дифференцированных клетках β-катенин постоянно образуется и разрушается ферментом GSK-3β. По данным Rashmi Srivastava [6], инактивация GSK-3β позволяет ОСК пролиферировать путем симметричного деления, подавляет аутофагию, обеспечивает переход от выживания к пролиферации, активизирует ангиогенез, фокальную адгезию и взаимодействие с внеклеточным матриксом. Указанное обстоятельство позволяет считать эту цель патогенетически обоснованной и приоритетной.

При этом Barzegar Behrooz приводит данные [7], что фермент GSK-3β испытывает мощное влияние со стороны белка АКТ1, продукта экспрессии гена akt1, ключевого компонента сигнального пути PI3K/AKT/mTOR. Данный белок способен подавлять функциональную активность GSK-3β и повышать содержание CTNNB1/β-катенина. Branavan Manoranjan в соавторстве с одним из авторов концепции ОСК глиобластомы Sheila Singh [8] приводит аргументы в пользу существования сигнальной оси CD133-AKT-Wnt, напрямую, без участия wnt-лигандов, способной регулировать активность генов плюрипотентности и пролиферативной активности ОСК. В пользу этого тезиса в нашем исследовании указывает многократное повышение содержание мРНК гена akt1 и ctnnbp1, белка CTNNB1 в CD133⁺ ОСК, а также значимое повышение АКТ1 в облученных ОК. Указанные обстоятельства позволяют рассматривать АКТ1 как приоритетную цель. По данным Kyung-Ho Jung [9], ее поражение потенциально возможно с использованием препарата из группы НПВС – целекоксиба, который угнетает АКТ1 и снижает содержание β-катенина в ОСК. При этом свободно проходит через гематоэнцефалический барьер.

Важно, что помимо ctnnb1 и akt1 в CD133⁺ ОСК многократно усилена экспрессия генов col6a1 и lamb1 – белковых субъединиц коллагена и ламинина – компонентов системы фокальной адгезии и рецепторного взаимодействия с внеклеточным матриксом, уровень экспрессии которых в ОСК усилен более чем в 4 раза. По данным Ding-Xi Liu [10], активность этих механизмов напрямую связана с содержанием β-катенина, это позволяет предположить, что подавление АКТ1 и CTNNB1 может нарушить механизмы формирования ниши ОСК и стать сигналом к апоптозу, что ставит новые задачи для дальнейших экспериментов.

ДЭГ hdac1 играет особо важную роль в биологии ОСК, продукт его экспрессии – белок HDAC1 модифицирует гистоновые белки и регулирует экспрессию генов, управляющих пролиферацией ОСК, подавляет механизмы пластичности и репарации ДНК, усиливает эффект лучевой и химиотерапии. По данным Adarsh Gopinathan [11], для поражения этой мишени потенциально привлекательны вальпроевая кислота и вориностат, что позволяет перейти к клиническому применению полученных данных уже в ближайшее время.

Далее целесообразно остановиться на мишенях, уровень экспрессии которых в ОСК усилен более 4 раза.

Ген ahnak2, белковый продукт которого AHNAK нуклеопротеин 2 усиливает экспрессию в ОСК более чем в 4 раза. По данным базы GC, функция белка связана с передачей кальциевых сигналов через кальциевые каналы. Ген описан Bi-Tian Zhang [12] в списке генов, обеспечивающих функционирование сигнального пути PI3K-Akt, что является дополнительным аргументом в пользу рассмотрения АКТ1 как приоритетной мишени.

Ген pik3cg, каталитическая субъединица γ фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-3-киназы, – каталитическая субъединица фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) класса IB, усиливает экспрессию в ОСК более чем в 4,1 раза по сравнению с ДОК. Mehrdad Hashemi [13] указывает, что инактивация этого гена – основной способ регуляции сигнальной оси PTEN/PI3K/AKT при лечении ГБ. При этом важно заметить, что данный автор не указывает способа инактивации этой мишени, в то время как Barzegar Behrooz [7] говорит, что подавление нижележащего фермента – АКТ1 представляет собой большую клиническую перспективу. В свете данной дискуссии важно, что оба автора признают роль этой мишени в регуляции функции ОСК, что позволяет считать ее патогенетически значимой и важной.

Ген mctp1, кодирующий множественный белок 1, содержащий домен C₂ и трансмембранный домен, усиливает экспрессию в ОСК более чем в 4 раза по сравнению с ДОК. Информация о роли этого гена или кодируемого им белка в биологии ОСК практически отсутствует. По данным баз биологической информации GC и STRING, этот белок, негативно регулирующий эндоцитоз и ответ на окислительный стресс, вовлечен в процессы кальциевой трансмиссии и синаптической пластичности. Роль данной мишени в терапии ГБ нуждается в дальнейшем уточнении.

Ген il31ra кодирует белок рецептора интерлейкина-31А, усиливает экспрессию в ОСК более чем в 4 раза по сравнению с ДОК. По данным базы STRING, продукт экспрессии гена IL31RA – белковая субъединица рецептора для интерлейкина-6, регулирующая аттрактивно-пермиссивные отношения между различными клеточными элементами в очаге воспаления. Chaocai Zhang [14] высказано мнение, что через эту мишень возможно управление энергетическим метаболизмом ОК, однако более целесообразно рассматривать эту мишень в контакте потенциальной чувствительности к иммунотерапии.

Ген ca9, белковый продукт которого карбоангидраза IX усиливает экспрессию в ОСК в 4,1 раза по сравнению с ДОК. По данным базы GC, этот ген кодирует белок семейства цинковых металлоферментов, катализирующих обратимую гидратацию СO₂. Информация о его роли в клетках ГБ практически отсутствует, эта мишень нуждается в дальнейшем изучении.

Ген csnk2b, казеин киназа 2β, усиливает экспрессию в ОСК более чем в 4 раза по сравнению с ДОК. CSNK2B – компонент канонического сигнального пути Wnt – регулирует клеточный цикл, апоптоз и транскрипцию, является важнейшим компонентом «комплекса деградации» β-катенина, участвует в модерации сигналинга NF-κB в клетках ГБ. Michael Latour [15] предлагает рассматривать эту мишень вместе с β-катенином и продуктом экспрессии гена daam1 – активатором морфогенеза 1, ассоциированным с Dishevelled как единый комплекс целей сигнального пути Wnt. Однако такой подход не всегда оправдан, поскольку разрушение компонентов «комплекса деградации» β-катенина не способствует снижению функциональной активности ОСК. Более целесообразно рассматривать эти ДЭГ как мишени второго порядка, потенциально применимые для подавления ОСК.

В свете сказанного ОСК представляет собой открытую систему, располагающую особыми внутриклеточными молекулярными механизмами для межклеточного взаимодействия. Регуляция этих целей возможна с использованием как специфических таргетных средств, так и репозиционируемых лекарственных препаратов.

Выводы

Фармакологическими мишенями в ОСК являются белки АКТ1, HDAC1, CTNNB1 – продукты экспрессии генов akt1, hdac1, ctnnb1, к целям второго порядка следует отнести белковые продукты генов ahnak2, daam, pik3cg, mctp1, Il31ra, ca9, csnk2b, col6a1, col6a3 и lambd1.